敲除SIRT1基因?qū)π∈驛ML-12細(xì)胞中SFRS10、Lipin1表達(dá)的影響.pdf

1、目的：酒精性肝?。╝lcoholic liver disease，ALD）是因長期過量飲酒引起的中毒性肝臟疾病，其中包括輕癥ALD、酒精性脂肪肝(alcohol fatty liver disease，AFLD）、酒精性肝炎、酒精性肝纖維化和酒精性肝硬化等類型。嚴(yán)重酗酒時(shí)可誘發(fā)廣泛肝細(xì)胞壞死，甚至肝功能衰竭。ALD病因明確，但其發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚，可能與酒精及其代謝產(chǎn)物對肝臟的毒性作用、氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化、免疫反應(yīng)與內(nèi)毒素、細(xì)胞

2、因子等密切相關(guān)。我們應(yīng)用酒精灌胃建立的大鼠ALD模型發(fā)現(xiàn)，肝組織SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)逐漸減少的同時(shí)SFRS10 mRNA和蛋白的表達(dá)逐漸減弱，總Lipin1及細(xì)胞質(zhì)中Lipin1-β的表達(dá)逐漸增多而細(xì)胞核中的Lipin1-α表達(dá)逐漸減少。Pihlajam?ki等研究發(fā)現(xiàn)在肥胖患者和高脂飲食小鼠肝組織中SFRS10表達(dá)減弱，且SFRS10的表達(dá)量與選擇性剪接表達(dá)Lipin1的功能亞型有關(guān)。Yin等報(bào)道酒精以濃度依賴的方式抑制小鼠

3、肝細(xì)胞株SIRT1表達(dá)的同時(shí)SFRS10表達(dá)減弱。因此，抑制SIRT1的表達(dá)對SFRS10以及Lipin1表達(dá)的影響值得進(jìn)一步研究。本研究選用能代謝酒精的小鼠AML-12細(xì)胞，給予梯度酒精培養(yǎng)及siRNA干擾敲除SIRT1基因，應(yīng)用RT-qPCR和Western blot法檢測SFRS10，Lipin1，Lipin1-β和Lipin1-α的mRNA和蛋白表達(dá)；應(yīng)用油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積；應(yīng)用免疫熒光染色觀察Lipin1的細(xì)胞定位。

4、在細(xì)胞水平闡明抑制SIRT1的表達(dá)對SFRS10、Lipin1表達(dá)的影響。
　　方法：復(fù)蘇AML-12細(xì)胞用含10％胎牛血清、1%丙酮酸鈉、1‰的HEPES、1%青鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基在5%CO2，37℃條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期，梯度酒精培育AML-12細(xì)胞，根據(jù)不同酒精濃度，分為0mM組（正常對照組）、40mM組、80mM組、120mM組；敲除SIRT1基因，分為空白對照組（Blank）、SIRT1siRNA陰性對照組（SI

5、RT1siRNA NC）、SIRT1siRNA組、SIRT1siRNA+Ethanol組。
　　1.首先實(shí)驗(yàn)組分別用40mM、80mM、120mM濃度的酒精培育AML-12細(xì)胞，對照組常規(guī)培養(yǎng)并加入等體積無菌生理鹽水，培養(yǎng)24h后，吸取舊培養(yǎng)液,收集細(xì)胞，分別應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶連反應(yīng)（Real Time-quantitative Polymerase Chain Reaction，RT-qPCR）和Western blot法檢

6、測SIRT1、剪切因子SFRS10和Lipin1（核、漿）的mRNA和蛋白表達(dá)水平；用4%多聚甲醛固定，行油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積；行免疫熒光染色，觀察Lipin1的胞漿或胞核分布。
　　2.實(shí)驗(yàn)組分別將SIRT1siRNA陰性對照序列、SIRT1siRNA轉(zhuǎn)染至AML-12細(xì)胞，以僅加相同體積的脂質(zhì)體作為空白對照組，培養(yǎng)6h后，更換為新鮮完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至24小時(shí)，SIRT1siRNA+Ethanol組給予120mM濃度的

7、酒精，余組加等體積的生理鹽水，繼續(xù)培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞，分別應(yīng)用RT-qPCR和Western blot法檢測SIRT1、剪切因子SFRS10和Lipin1（核、漿）的mRNA和蛋白表達(dá)水平；用4%多聚甲醛固定，行油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積；行免疫熒光染色，觀察Lipin1的胞漿或胞核分布。
　　結(jié)果：
　　1.梯度酒精（0mM、40mM、80mM、120mM）刺激AML-12細(xì)胞，各個(gè)指標(biāo)mRNA和蛋白表達(dá)變化及細(xì)胞病理

8、學(xué)改變
　　1.1 RT-qPCR法檢測SIRT1、SFRS10、總Lipin1、Lipin1-β及Lipin1-αmRNA的表達(dá)變化：如Fig.1及Table2所示，正常AML-12細(xì)胞中表達(dá)SIRT1，SFRS10較多，總的Lipin1，細(xì)胞質(zhì)Lipin1-β及細(xì)胞核Lipin1-α表達(dá)均較少，隨著酒精濃度的增加，SIRT1表達(dá)逐漸減少，SFRS10的表達(dá)逐漸減弱；總的Lipin1和細(xì)胞質(zhì)中Lipin1-β表達(dá)量均逐漸增多，而

9、細(xì)胞核中Lipin1-α表達(dá)逐漸減少（F值分別為35.64，16.59，100.81，78.92，28.41，P均<0.01）。如Fig.2及Table3所示，隨著酒精濃度增加，Lipin1-β/α比值逐漸升高（F值為119.98，P均<0.01）。
　　1.2 Western blot法檢測SIRT1、SFRS10、總Lipin1、Lipin1-β及Lipin1-α的蛋白水平表達(dá)變化：如Fig.4及Table4所示，正常AML-

10、12細(xì)胞中表達(dá)SIRT1，SFRS10較多，總的Lipin1，細(xì)胞質(zhì)Lipin1-β及細(xì)胞核Lipin1-α表達(dá)均較少，隨著酒精濃度的增加，SIRT1表達(dá)逐漸減少，SFRS10的表達(dá)逐漸減弱；總的Lipin1和細(xì)胞質(zhì)中Lipin1-β表達(dá)量均逐漸增多，而細(xì)胞核中Lipin1-α表達(dá)逐漸減少（F值分別為64.79，74.46，97.11，71.74，57.62，P均<0.01）。
　　1.3 油紅O染色法觀察小鼠AML-12細(xì)胞內(nèi)的

11、脂變：如Fig.5所示，正常對照組（0mM組）AML-12細(xì)胞內(nèi)未見脂肪變性，40mM濃度酒精刺激時(shí)， AML-12細(xì)胞內(nèi)可見少量橘紅色脂滴，120mM濃度酒精刺激時(shí)，AML-12細(xì)胞內(nèi)可見較多的橘紅色脂滴。
　　1.4 免疫熒光染色法觀察小鼠AML-12細(xì)胞中Lipin1蛋白的細(xì)胞定位：如Fig.6所示，正常對照組示Lipin1蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核也表達(dá)少量的Lipin1蛋白。隨著酒精濃度的增加，細(xì)胞質(zhì)中Lipin1蛋白表

12、達(dá)逐漸增多，細(xì)胞核中的Lipin1蛋白表達(dá)逐漸減少。
　　2.敲除小鼠AML-12細(xì)胞中SIRT1基因，各個(gè)指標(biāo)mRNA和蛋白表達(dá)變化及細(xì)胞病理學(xué)改變
　　2.1 敲除SIRT1基因通過RT-qPCR法檢測SIRT1、SFRS10、總Lipin1、Lipin1-β及Lipin1-αmRNA的表達(dá)：如Fig.7及Table5所示，正常AML-12細(xì)胞中表達(dá)SIRT1、SFRS10較多，總的Lipin1、細(xì)胞質(zhì)Lipin1-β及

13、細(xì)胞核Lipin1-α表達(dá)均較少，敲除SIRT1基因，SIRT1siRNA組與空白對照組比較，SIRT1的表達(dá)降低約42%的同時(shí)SFRS10的表達(dá)明顯減少，總的Lipin1和細(xì)胞質(zhì)中Lipin1-β表達(dá)量明顯增多，而細(xì)胞核中Lipin1-α表達(dá)明顯減少（P均<0.01）；在敲除SIRT1基因并加入酒精刺激后，SIRT1、SFRS10、Lipin1-α表達(dá)進(jìn)一步減少，總Lipin1、細(xì)胞質(zhì)Lipin1-β的表達(dá)進(jìn)一步增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

14、義（P<0.05或P<0.01）；SIRT1siRNA陰性對照組和空白對照組比較，各個(gè)指標(biāo)表達(dá)的變化，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05）。如Fig.8及Table6所示，Lipin1-β/α的比值，敲除基因SIRT1，SIRT1siRNA組與空白對照組比較，Lipin1-β/α的比值明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在敲除SIRT1基因并加入酒精刺激后，Lipin1-β/α的比值進(jìn)一步升高，SIRT1siRNA+Ethano

15、l組與 SIRT1siRNA組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　2.2 敲除SIRT1基因通過Western blot法檢測SIRT1、SFRS10、總Lipin1、Lipin1-β及Lipin1-α的蛋白水平表達(dá)變化：如Fig.10及Table7所示，正常AML-12細(xì)胞中表達(dá)SIRT1、SFRS10較多，總Lipin1、細(xì)胞質(zhì)Lipin1-β及細(xì)胞核Lipin1-α表達(dá)均較少，敲除SIRT1基因，SIRT1siRN

16、A組與空白對照組比較，SIRT1的表達(dá)降低45%的同時(shí)SFRS10的表達(dá)明顯減少，總的Lipin1和細(xì)胞質(zhì)中Lipin1-β表達(dá)明顯增多，而細(xì)胞核中Lipin1-α表達(dá)明顯減少（P均<0.01）；在敲除SIRT1基因并加入酒精刺激后，SIRT1、SFRS10、Lipin1-α表達(dá)進(jìn)一步減少，總Lipin1、細(xì)胞質(zhì)Lipin1-β的表達(dá)進(jìn)一步增加，SIRT1siRNA+Ethanol組與 SIRT1siRNA組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

17、均<0.01）。而各個(gè)指標(biāo)中SIRT1siRNA陰性對照組和空白對照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05）。
　　2.3 油紅O染色法觀察小鼠AML-12細(xì)胞內(nèi)的脂變：如Fig.11所示，油紅O染色示正常對照組及陰性對照組中AML-12細(xì)胞內(nèi)未見脂肪變性，敲除SIRT1基因，AML-12細(xì)胞內(nèi)可見較多的橘紅色脂滴，敲除SIRT1基因并加入120mM濃度酒精刺激，AML-12細(xì)胞內(nèi)可見大量的橘紅色脂滴。
　　2.4 免疫

18、熒光染色法觀察小鼠AML-12細(xì)胞中Lipin1蛋白的細(xì)胞定位：如Fig.12所示，正常對照組及陰性對照組示Lipin1蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核也表達(dá)少量Lipin1蛋白。敲除SIRT1基因，細(xì)胞質(zhì)中的Lipin1蛋白表達(dá)明顯增多，細(xì)胞核中的Lipin1蛋白表達(dá)明顯減少。敲除SIRT1基因并加入120mM濃度酒精刺激，細(xì)胞質(zhì)中的Lipin1蛋白表達(dá)進(jìn)一步增多，細(xì)胞核中的Lipin1蛋白表達(dá)進(jìn)一步減少。
　　結(jié)論：SIRT1上游調(diào)