29458.來源于pedobactersp.mj11的α半乳糖苷酶基因克隆、表達及其性質研究_第1頁
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1、東北農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文來源于Pedobactersp.MJ11的α半乳糖苷酶基因克隆、表達及其性質研究姓名：劉小丹申請學位級別：碩士專業(yè)：微生物學指導教師：許修宏20090612AbstractIIIGeneCloningExpressionacterizationofαgalactosidasefromPedobactersp.MJ11AbstractαGalactosidasemelibiase(αDgalactosidegala

2、ctohydrolaseEC3.2.1.22)isanexoglycosidasethatcatalyticallyremovesαlinkedterminalnonreducinggalactoseresiduesindifferentsubstrates.αGalactosidasewaswidelydistributedinanimalsplantsmicroganisms.microganismwasthemainsources

3、ofthisenzymeftheirvariousspecieswidelydistributionstronglyadaption.Basedontheaminoacidsequencesimilaritiesαgalactosidaseshavebeenclassifiedintoglycosidehydrolase(GH)familiesof4273657.TheGH27GH36familiescontainthemajityof

4、knownαgalactosidases.MostαgalactosidasesofGH27arefromeukaryotethoseofGH36arefromprokaryote.αGalactosidaseshaveanumberofcommercialapplicationssuchasintheprocessingoffoodproductanimalfeedprocessingmedicinechemicalindustrys

5、oon.Atpresenttherearetwomainproblemsinthestudyofαgalactosidases:oneisdiscoveryofenzymewithgoodpropertiesanotherishighlevelexpressionofαgalactosidasetoscaletheproductionsolveproblemsinapplication.Inthisstudybyusingbioinfm

6、aticalmethodtheaminoacidsequenceofmicrobialαgalactosidasesfromglycosidehydrolase(GH)familie36withmolecularweightwithintherange7080kDawerealignedanalyzed.TwoconservativemotifDDGWEPEMwerechosentodesigneddegeneratedprimers.

7、FragmentofαgalactosidasewasclonedfromPedobactersp.MJ11byusingdegeneratedPCRmethodthefulllengthgenewasobtainedwithTAILPCRcloningmethods.TheαgalactosidasegeneofPedobactersp.MJ11wassubjecttoheterogeneousexpressioninEscheric

8、hiacoliBL21(DE3)functionverificationpurificationacterization.Thegeneconsistedof2166nucleotidesencodingaproteinof721aminoacidsaterminalcodon.Theαgalactosidasegenewasassignedtofamily36oftheglycosylhydrolasesthededucedamino

9、acidsequencesharesthehighestidentityof54%withtheαgalactosidasefromBacteroidesthetaiotaomicron.Allthatindicatedhighnoveltyoftheαgalactosidasegenes.TheexpressedrecombinantenzymeAgaMJ11Hhasamolecularweightof8[AC3]0kDawhichi

10、sagreetothecalculatedmolecularweightofthematureenzymefromthededucedaminoacidsequenceofagaMJ11wasfurtheridentifiedbyMSbasedinternalsequenceanalysis.TheoptimumofpHtemperatureofthepurifiedenzymewas5.540Crespectivelytheenzym

11、ewasstableinrangeofpH4.0–10.0.Therecombinantenzymeshowedthehydrolyticactivityfoligomericsubstratessuchasraffinosestachyosemelibiose.TheKmfpNPGmelibioseweredeterminedas2.9422.37mMrespectively.[AC4]Thepurifiedenzymealsosho

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