多聚左旋精氨酸通過ERK1-2信號通路誘導NCI-H292細胞凋亡的機制研究.pdf

1、目的：
　　研究多聚左旋精氨酸（Poly-L-arginine，PLA）誘導氣道上皮細胞 NCI-H292細胞凋亡的通路機制以及對細胞內 Bcl-2/Bax、Caspase-3表達的影響，從而揭示PLA參與哮喘氣道上皮損傷的部分機制。
　　方法：
　　1、細胞培養(yǎng)
　　常規(guī)培養(yǎng)基（RPMI1640+10%胎牛血清）培養(yǎng)NCI-H292細胞，于37℃、5%二氧化碳環(huán)境的培養(yǎng)箱內孵育。每2～3天換液一次，細胞分裂鋪展

2、至培養(yǎng)瓶70%～80%時用0.25%胰酶消化傳代，用于后續(xù)實驗。
　　2、透射電鏡制片觀察 NCI-H292細胞凋亡
　　NCI-H292細胞分為對照組、PLA（60 mg/L）組兩組，PLA作用24 h后，收集細胞，固定后脫水，包埋干燥，切片浸染后用透射電鏡攝片觀察兩組細胞的超微結構。
　　3、Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測細胞凋亡率
　　按加入PLA濃度不同將細胞分為空白對照組、10 mg/L

3、 PLA組、20 mg/L組PLA、40 mg/L PLA組、60 mg/L PLA組，按是否加入ERK1/2信號通路抑制劑PD98059分為空白對照組、PD組、PLA組、PLA+PD組。收集各組細胞后，運用流式細胞儀檢測凋亡率，flowjo軟件分析凋亡結果。
　　4、Western Blot法檢測凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2、Casepase-3及信號通路ERK1/2的表達
　　采用Western Blot法分析在不同濃

4、度PLA（0、10、20、40、60 mg/L）刺激下Bax、Bcl-2、Casepase-3和 ERK1/2的蛋白含量，并比較 ERK信號通路抑制劑PD98059（20μmol/L）作用前后對 Bcl-2/Bax、Casepase-3和 ERK1/2磷酸化的影響。
　　5、統(tǒng)計學處理
　　采用統(tǒng)計學軟件SPSS16.0進行處理分析，數據以-x±s表示，數據均進行正態(tài)性檢驗，多組間比較采用單因素方差分析(One-Way AN

5、OVA)；兩兩間比較采用LSD-t檢驗。所有實驗均重復不少于3次。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1、電鏡下可見PLA刺激后的NCI-H292細胞核膜皺縮外突，染色質在核膜下濃聚；線粒體腫脹變圓、呈空泡狀，線粒體嵴排列雜亂多不規(guī)則，數量明顯減少，甚至部分消失，呈明顯凋亡改變。
　　2、Annexin V-FITC/PI雙染法凋亡檢測顯示，對照組、10 mg/L PLA組、20 mg/L PLA組、40

6、 mg/L PLA組、60 mg/L PLA組NCI-H292細胞凋亡率分別為（4.97±0.17）%，（7.82±0.21）%，（11.99±0.21）%，（29.52±0.55）%，（55.23±0.67）%，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001），并呈濃度依賴性。
　　3、Western Blot檢測10 mg/L PLA組、20 mg/L PLA組、40 mg/L PLA組、60 mg/L PLA組的Bcl-2/

7、Bax比值相對于空白對照組皆顯示降低趨勢，差異都有統(tǒng)計學意義（P均<0.01）；在活性Caspase-3蛋白表達水平的檢測中，10 mg/L PLA組、20 mg/L PLA組、40 mg/L PLA組、60 mg/L PLA組的活性Caspase-3蛋白表達量比之于對照組都有所增加，有統(tǒng)計學差異（P均<0.001）。
　　4、與空白對照組相比較，10 mg/L PLA組、20 mg/L PLA組、40 mg/L PLA組、60

8、mg/L PLA組ERK磷酸化水平均增加（P均<0.01），且在PLA終濃度為20mg/L時，P-ERK/ERK的表達量達到高峰（P<0.01）。
　　5、空白對照組、PD組、PLA組、PLA+PD組 NCI-H292細胞凋亡率分別為（5.04±0.26）%、（4.99±0.19）%（P=0.801）、（20.72±1.37）%（P<0.001）、（8.67±0.18）%（P<0.001），且PLA+PD組凋亡率明顯低于PLA組，

9、其差異統(tǒng)計學意義（P<0.001）。
　　6、PLA+PD組相比PLA組Bcl-2/Bax明顯升高，活性Caspase-3明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.001)。與空白對照組相較，PLA組活性P-ERK/ERK表達水平明顯升高（P<0.001）；PLA+PD組相比PLA組P-ERK/ERK明顯降低（P<0.001)。
　　結論：
　　1、PLA可誘導氣道上皮細胞凋亡；
　　2、PLA可能通過激活 Bax、