芷辛方治療癌痛及TLr-NF-kappa B信號通路的機制研究.pdf

1、癌痛是臨床晚期癌癥患者最常見的癥狀之一，一半以上的癌癥患者會經歷劇烈且很難控制的疼痛，雖然嗎啡等阿片類藥物對癌痛的療效顯著，但是，伴隨成癮性、胃腸道反應等副作用。因此，緩解疼痛是臨床醫(yī)生面臨的最大的難題。癌痛是一個復雜的病理學過程，同時也是臨床上的一大難題。癌痛屬于慢性疼痛的范疇，與炎癥痛和神經病理性疼痛機制相比，有相似之處，也有其獨特而復雜之處。所以建立合適的動物模型對于深入的研究癌痛機制就顯得非常重要。自1999年Schwei首次報

2、道了小鼠骨癌痛模型以來，其它癌痛動物模型也相繼產生，這將對癌痛機制的深入探討、尋找緩解癌痛新方法、篩選有效的鎮(zhèn)痛藥物提供極為有效的途徑。為了給臨床上癌痛的治療提供更可靠、有效的方法，研究者通過構建適當?shù)墓前┩磩游锬Ｐ瓦M行對癌痛的機制和治療的基礎研究。
　　中藥鎮(zhèn)痛是祖國醫(yī)學的偉大智慧結晶，因作用廣、毒副作用小并而且經濟簡便而普遍被患者接受。國內外大量研究表明，中藥對急性或者慢性疼痛都能起到一定的鎮(zhèn)痛作用。臨床實踐表明，中藥用于癌痛

3、病人，不僅能夠鎮(zhèn)痛，還能通過調節(jié)癌癥患者的免疫功能，從而達到提高癌癥患者生活質量的治療目的。但是長期以來，由于缺乏合適的癌痛實驗動物模型，阻礙了對癌痛機理的研究，同時也影響了新型有效的癌痛治療方法的研究，包括一些癌痛新藥及針刺等非藥物治療的方法。
　　相關實驗數(shù)據(jù)表明，神經膠質細胞與慢性疼痛密切相關。膠質細胞（星形膠質細胞、小膠質細胞）在主要的痛覺傳遞物質中起著重要的作用。此外，膠質細胞釋放出的致炎細胞因子（包括TNF-α、IL-

4、1β、IL-6等）都是引起痛覺傳遞神經元敏化的主要因素，促進中樞敏化的形成。由此可見，膠質細胞在痛覺的初級傳入和發(fā)展過程中至關重要，以及在痛覺調節(jié)特別是疼痛中樞敏化的形成與維持中舉足輕重。
　　芷辛方是河南省中醫(yī)藥研究院著名研究員張海岑50多年的臨床經驗方，芷辛方由白芷、細辛、川芎等藥物組成，具有溫經通絡、活血化痹、祛風止痛的功效。經臨床研究證實，芷辛方用于治療包括骨癌痛在內的多種痛癥，效果顯著。綜上所示，本論文開展以下研究:

5、r>　　1.參照以往文獻報道建立癌痛動物模型以尋找有效緩解疼痛的方法，并進一步探討芷辛方的鎮(zhèn)痛作用。通過對模型大鼠體重、脛骨病理、脛骨X光片、后肢熱痛覺過敏、機械性痛覺超敏（觸誘發(fā)痛）以及自發(fā)性疼痛的研究對模型進行綜合評估。
　　2.觀察癌痛時大鼠脊髓內膠質細胞以及相關機制作用下指標的變化。
　　1)用免疫組化對各組大鼠脛骨癌痛時脊髓星型膠質細胞標志蛋白GFAP(GlialFibrillary Acidic Protein，

6、膠質纖維酸性蛋白)進行檢測;
　　2)用Western Blot對各組大鼠脛骨癌痛時脊髓NF-KB(Nuclear factor-kappa B，核因子κB)和SIGIRR進行檢測;
　　3)用RT-PCR對脊髓小膠質細胞標志性蛋白CD11b和Toll受體2(TLR2)及4(TLR4)進行檢測;
　　4)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)對各組大鼠脛骨癌痛時致炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6進行檢測。
　　結果

7、如下:
　　1.骨癌痛模型的建立
　　通過對大鼠左脛骨內接種含有3×103個Walker256嫁接的腹水瘤細胞液造模，實驗結果所示，骨癌痛模型組與空白組體重顯示非常顯著性差異，且骨癌痛模型組的體重增加遲緩甚至呈下降趨勢（P＜0.01）。骨癌痛模型組比空白組動痛大鼠自發(fā)性運動呈現(xiàn)出非常顯著性差異，且明顯呈上升趨勢（P＜0.01）。和空白組相比較，機械痛覺超敏骨癌痛模型組與空白組相比呈現(xiàn)出非常顯著性差異，且明顯的下降趨勢（P＜0

8、.01）。和空白組相比較，大鼠模型組手術側脛骨的X線影像以及HE染色顯示骨結構發(fā)生明顯改變和破壞。
　　2.大鼠脛骨癌痛時脊髓背角膠質細胞功能活動變化
　　實驗分為空白對照組、骨癌痛模型組、西藥對照組（鹽酸曲馬多，10μ g·kg-1）、中藥對照組（五靈止痛膠囊，60μ g·kg-1）、高劑量芷辛方治療組、正常劑量芷辛方治療組、低劑量芷辛方治療組（芷辛方高、中、低水煎濃縮制劑分別為9 g·kg-1、4.5 g·kg-1、2.

9、25g· kg-1生藥/只），并于造模14 d后開始灌胃，每日一次，連續(xù)7d。第21 d，取各組大鼠血清、手術側脛骨及其脊髓腰膨大段(L4～L6)，并對其組織進行免疫組織化學、WesternBlot、RT-PCR等形態(tài)學及分子生物學技術檢測。
　　1)免疫組化檢測骨癌痛模型組的髓內星形膠質細胞的標記蛋白GFAP，呈現(xiàn)明顯升高，且明顯多于空白組、芷辛正常劑量組和芷辛高劑量組。骨癌痛發(fā)生時，星形膠質細胞增生肥大，芷辛方對其具有抑制鎮(zhèn)痛

10、作用。
　　2) PCR檢測小膠質細胞標志性蛋白CD11b，骨癌痛模型組的CD11b mRNA明顯高于芷辛正常劑量和芷辛高劑量（P＜0.01)。表明骨癌痛時，小膠質細胞表現(xiàn)為增殖活化，芷辛方對其有抑制鎮(zhèn)痛的作用。
　　3)芷辛方干預治療的骨癌痛組的中樞神經系統(tǒng)免疫活性重要因子TLR2、TLR4 mRNA與骨癌痛模型組出現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）。骨癌痛模型組的NF-κB/GAPDH的蛋白水平與正常組和芷辛高劑量組的表達出現(xiàn)

11、顯著性差異（P＜0.05）。結果顯示，中樞疼痛TLR-NF-κB信息通路被激活，芷辛方通過對TLR的抑制從而達到對其下游通路的抑制和治療作用，進而達到止痛的效果。
　　4)骨癌痛模型組髓內的SIGIRR(Single Ig IL-1-related receptor，單一免疫球蛋白白細胞介素1受體相關蛋白)蛋白表達與芷辛高劑量組、芷辛正常劑量組的表達出現(xiàn)非常顯著性差異(P＜0.01)，這與NF-κB的結果相反。實驗發(fā)現(xiàn)，芷辛高劑量

12、組的表達高于空白組，而芷辛正常劑量組的表達與西藥組接近。提示著芷辛方通過對SIGIRR的活化從而達到對NF-κ B的抑制作用，這可能是芷辛方降低和治療癌痛的機制之一。
　　5)大鼠脛骨癌痛時致炎因子TNF-α(Tumor Necrosis Factor-α，腫瘤壞死因子-α)、IL-1β(Interleukin-1 beta，白細胞介素-1beta)、IL-6(Interleukin-6，白細胞介素-6)的表達變化
　　芷辛

13、方高劑量治療組、空白組的IL-1β表達低于骨癌痛模型組，存在非常顯著性差異(P＜0.01)，而芷辛方正常劑量治療組的IL-1β表達與骨癌痛模型組，存在明顯的差異(P＜0.05)。不僅如此，芷辛方高劑量治療組、空白組的IL-6、TNF-α表達低于骨癌痛模型組，存在非常顯著性差異（P＜0.01）;芷辛方正常劑量治療組的的IL-6與骨癌痛模型組存在明顯的差異(P＜0.05)。
　　結論:骨癌痛發(fā)生時，脊髓水平膠質細胞的增殖活化與TLR-