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文檔簡介
1、膿毒癥(Sepsis)是由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征(Systemic inflammatory response syndrome,SIRS)。小膠質(zhì)細(xì)胞(microglia,MG)是神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的免疫細(xì)胞,主要表達(dá)TLR4受體,其TLR4都存在于細(xì)胞膜上,可特異地識別脂多糖,觸發(fā)SIRS。亞低溫在神經(jīng)系統(tǒng)的各種疾病的治療中已取得了明顯的優(yōu)勢,并被列入2010年的美國心肺復(fù)蘇指南。但亞低溫對膿毒癥病程中腦保護(hù)的機(jī)制尚不清楚。我們進(jìn)行此
2、項研究,以了解亞低溫是否通過影響小膠質(zhì)細(xì)胞的TLR4/NF-kappaB信號通路從而抑制炎癥因子的釋放,達(dá)到神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用。
目的:
了解亞低溫治療對內(nèi)毒素(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞的TLR4/NF-kappaB信號通路的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)以及炎癥因子釋放的影響。
方法:
以LPS感染體外培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞,將培養(yǎng)后的小膠質(zhì)細(xì)胞分為四組:37℃-NS組(正常對照組)
3、、37℃-LPS組、33℃-NS組和33℃-LPS組,于感染后的0h、2h、6h、12h和24h各時間點收集各組細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)上清,同時以不同溫度下的未感染細(xì)胞作為正常對照組。
1.用TRIzol提取細(xì)胞中RNA,通過實時定量PCR檢測小膠質(zhì)細(xì)胞中TLR4、NF-κB mRNA轉(zhuǎn)錄水平。
2.用免疫印跡法(Western-blot)法檢測各組細(xì)胞中TLR4、NF-κB蛋白的表達(dá)水平,
3.用酶聯(lián)免疫吸附法(
4、ELISA)檢測各組細(xì)胞上清中腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素10(IL-10)的水平。
4.用MTT法檢測各組細(xì)胞增殖情況。所得數(shù)據(jù)均經(jīng)統(tǒng)計學(xué)軟件分析。
結(jié)果:
1.37℃-LPS組:隨著誘導(dǎo)時間的延長炎癥因子TNF-α、IL-10的含量逐漸升高;在LPS介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞的不同時間點,可上調(diào)TLR4、NF-κB基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá),且其表達(dá)量均隨時間的延長逐漸升高;且細(xì)胞中TLR4、NF-κB蛋白含量
5、表達(dá)均與LPS刺激之間有時間依賴性關(guān)系;
2.33℃-LPS組:隨著誘導(dǎo)時間的延長炎癥因子TNF-α、IL-10的含量逐漸升高,但與常溫LPS組相同時間點上清液中炎癥因子的含量比較明顯降低(TNF-?:2h:P<0.01;6h:P<0.01;12h:p<0.0001;24h:P<0.0001。IL-10:2h:P2<0.05;6h:P<0.005;12h:P<0.0001,24h:P<0.0001);在細(xì)胞中的TLR4、NF-
6、κB基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)有所下降,有統(tǒng)計學(xué)意義(TLR4 mRNA:0h:P=0.4496;2h:P<0.0001, P2<0.01;6h:P<0.0001,12h:P<0.0001,24h:P24<0.005;TLR4蛋白:0h:P=0.0763,2h:P<0.01;6h:P<0.01;12h:P<0.01;24h:P<0.0.01;NF-?B mRNA:0h:P=0.9048;2h:P=0.0001;6h:P=0.001;12h:P=0
7、.0001;24h:P=0.0001;NF-?B蛋白:0h:P=0.1277,2h:P<0.01;6h:P<0.05;12h:P<0.01;24h:P<0.001),且其表達(dá)量與誘導(dǎo)之間仍有時間依賴性;細(xì)胞中TLR4、NF-κB蛋白含量在檢測時間段內(nèi)隨時間的延長逐漸升高,但與常溫LPS組相同時間點比較其值明顯降低的,有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
3.對照組:常溫及亞低溫對照組的炎癥因子TNF-α、IL-10的含量在相同時間點
8、沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);不同溫度下的對照組細(xì)胞中Toll4、NF-κB基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白含量在相同時間點之間沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);正常對照組所檢測的數(shù)值與LPS組在相同時間點比較明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
結(jié)論:
在常溫條件下,LPS刺激小膠質(zhì)細(xì)胞觸發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng),使TLR4及其下游分子NF-κB的表達(dá)上調(diào),促炎因子TNF-α在早期明顯升高,抗炎因子IL-10的含量增加相對緩慢;在
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