亞低溫對LPS介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞TLR4-NF-kappaB信號通路的影響.pdf

1、膿毒癥（Sepsis)是由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征（Systemic inflammatory response syndrome,SIRS)。小膠質(zhì)細(xì)胞（microglia,MG）是神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的免疫細(xì)胞，主要表達(dá)TLR4受體，其TLR4都存在于細(xì)胞膜上，可特異地識別脂多糖，觸發(fā)SIRS。亞低溫在神經(jīng)系統(tǒng)的各種疾病的治療中已取得了明顯的優(yōu)勢，并被列入2010年的美國心肺復(fù)蘇指南。但亞低溫對膿毒癥病程中腦保護(hù)的機(jī)制尚不清楚。我們進(jìn)行此

2、項研究，以了解亞低溫是否通過影響小膠質(zhì)細(xì)胞的TLR4/NF-kappaB信號通路從而抑制炎癥因子的釋放，達(dá)到神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用。
　　目的：
　　了解亞低溫治療對內(nèi)毒素（lipopolysaccharide,LPS）誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞的TLR4/NF-kappaB信號通路的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)以及炎癥因子釋放的影響。
　　方法：
　　以LPS感染體外培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞，將培養(yǎng)后的小膠質(zhì)細(xì)胞分為四組：37℃-NS組(正常對照組)

3、、37℃-LPS組、33℃-NS組和33℃-LPS組，于感染后的0h、2h、6h、12h和24h各時間點收集各組細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)上清，同時以不同溫度下的未感染細(xì)胞作為正常對照組。
　　1.用TRIzol提取細(xì)胞中RNA,通過實時定量PCR檢測小膠質(zhì)細(xì)胞中TLR4、NF-κB mRNA轉(zhuǎn)錄水平。
　　2.用免疫印跡法（Western-blot）法檢測各組細(xì)胞中TLR4、NF-κB蛋白的表達(dá)水平，
　　3.用酶聯(lián)免疫吸附法（

4、ELISA）檢測各組細(xì)胞上清中腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素10（IL-10）的水平。
　　4.用MTT法檢測各組細(xì)胞增殖情況。所得數(shù)據(jù)均經(jīng)統(tǒng)計學(xué)軟件分析。
　　結(jié)果：
　　1.37℃-LPS組：隨著誘導(dǎo)時間的延長炎癥因子TNF-α、IL-10的含量逐漸升高；在LPS介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞的不同時間點，可上調(diào)TLR4、NF-κB基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)，且其表達(dá)量均隨時間的延長逐漸升高；且細(xì)胞中TLR4、NF-κB蛋白含量

5、表達(dá)均與LPS刺激之間有時間依賴性關(guān)系；
　　2.33℃-LPS組：隨著誘導(dǎo)時間的延長炎癥因子TNF-α、IL-10的含量逐漸升高，但與常溫LPS組相同時間點上清液中炎癥因子的含量比較明顯降低（TNF-?：2h:P<0.01；6h:P<0.01；12h:p<0.0001；24h:P<0.0001。IL-10：2h:P2<0.05；6h:P<0.005；12h:P<0.0001,24h:P<0.0001）；在細(xì)胞中的TLR4、NF-

6、κB基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)有所下降，有統(tǒng)計學(xué)意義（TLR4 mRNA：0h:P=0.4496；2h:P<0.0001, P2<0.01；6h:P<0.0001,12h:P<0.0001,24h:P24<0.005;TLR4蛋白：0h:P=0.0763,2h:P<0.01；6h:P<0.01；12h:P<0.01；24h:P<0.0.01；NF-?B mRNA：0h:P=0.9048；2h:P=0.0001；6h:P=0.001；12h:P=0

7、.0001；24h:P=0.0001；NF-?B蛋白：0h：P=0.1277,2h：P<0.01；6h:P<0.05；12h:P<0.01；24h:P<0.001），且其表達(dá)量與誘導(dǎo)之間仍有時間依賴性；細(xì)胞中TLR4、NF-κB蛋白含量在檢測時間段內(nèi)隨時間的延長逐漸升高，但與常溫LPS組相同時間點比較其值明顯降低的，有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　3．對照組：常溫及亞低溫對照組的炎癥因子TNF-α、IL-10的含量在相同時間點

8、沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；不同溫度下的對照組細(xì)胞中Toll4、NF-κB基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白含量在相同時間點之間沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；正常對照組所檢測的數(shù)值與LPS組在相同時間點比較明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　在常溫條件下，LPS刺激小膠質(zhì)細(xì)胞觸發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，使TLR4及其下游分子NF-κB的表達(dá)上調(diào)，促炎因子TNF-α在早期明顯升高，抗炎因子IL-10的含量增加相對緩慢；在