南方鲇PRL-cDNA克隆、組織分布和原核表達載體的構(gòu)建.pdf

1、2006年3月至2008年3月，用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆了南方鲇催乳素(PRL)的cDNA全長序列，并通過RT-PCR方法研究了南方鲇PRL的組織分布，同時成功構(gòu)建了南方鲇pET-28-PRL重組質(zhì)粒。 南方鲇PRL-cDNA全長1235bp，包括90bp的5’非編碼區(qū)(5’UTR)，639bp的蛋白質(zhì)編碼區(qū)即開放閱讀框(ORF)和506bp的3’端非編碼區(qū)(3’UTR)，真核生物保守的AATAAA加尾信號位于Poly(

2、A)上游22bp，多聚腺苷酸(PolyA)尾巴由17腺苷酸(A)組成。開放閱讀框編碼由212個氨基酸殘基組成的PRL前體，經(jīng)Iformax 2003軟件包的Vector NTI suite 9程序預(yù)測其分子量約為23kDa，等電點(PI)為8.19。SignalP預(yù)測該PRL前體包括由26個氨基酸殘基組成的信號肽和186個氨基酸殘基組成的成熟肽，成熟肽含有4個半胱氨酸殘基組成兩個二硫鍵，當PRL前體合成后，通過跨膜轉(zhuǎn)運出膜，信號肽被酶切

3、后釋放出PRL的成熟分子。 南方鲇PRL推導的氨基酸序列相似性分析發(fā)現(xiàn)：南方鲇PRL與印度囊鰓鲇和斑點叉尾鮰的PRL的相似性分別為89.2％和91.5％，與其他硬骨魚類PRL的相似性為51.0％-77.6％，與兩棲類、爬行類、鳥類和哺乳類PRL的相似性為27.9％-31.6％，與人類PRL的相似性為29.1％。系統(tǒng)進化分析表明，本研究克隆的南方鲇PRL和鲇形目魚類已經(jīng)克隆的印度囊鰓鲇和斑點叉尾鮰的PRL基因聚在一起，構(gòu)成一個單系

4、群，這與預(yù)期結(jié)果一致。 RT-PCR研究南方鲇PRL在各部腦、消化道各段、肝臟、胰腺、脾臟、腎、性腺、心臟，以及皮膚、肌肉、垂體等20種組織表達的結(jié)果表明，PRL在垂體表達量最高，其次為精巢、卵巢、端腦、間腦、中腦、小腦、延腦和嗅囊，肝臟、胰臟、腎、肌肉、心臟PRL低量表達，胃賁門部、胃體、胃幽門部和腸的前、中、后各段均無PRL的表達。與已有工作不同的是，研究南方鲇PRL基因的組織分布時擴大了取材范圍，并對各器官作了更細致的區(qū)分

5、，在此基礎(chǔ)上首次發(fā)現(xiàn)PRL基因在嗅囊表達。PRL基因在嗅囊中表達暗示PRL可能具有至今尚未被發(fā)現(xiàn)的新的功能，這為目前PRL功能研究這一熱點問題提供了新的線索。 本研究在得到南方鲇PRL-cDNA序列的基礎(chǔ)上，通過設(shè)計帶有酶切位點的引物，PCR擴增得到的產(chǎn)物經(jīng)TA克隆測序證明為編碼南方鲇PRL成熟肽的目的序列。將TA克隆構(gòu)建的重組質(zhì)粒與表達載體pET-28同時雙酶切，酶切產(chǎn)物用T4 DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞