FGF21在大腦神經(jīng)元細(xì)胞和腦內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)和與受體的相互作用.pdf

1、本文主要從以下幾方面進(jìn)行了論述：
　　第一部分 成纖維生長因子21(FGF21)對糖尿病鼠的快速降糖作用
　　目的:已有大量研究表明FGF21對糖代謝有調(diào)控作用，連續(xù)給藥7到14天后可以降低2型糖尿病型高血糖，還能增強(qiáng)胰島素的敏感性，降低胰島素抵抗。但很少有研究FGF21的快速降糖的作用?？焖俳堤菍τ谝愿哐菫椴l(fā)癥或者為主要危險因素的疾病例如急性創(chuàng)傷、炎癥以及心腦血管疾病等有重要的意義。
　　方法:本實(shí)驗(yàn)先用溫州醫(yī)學(xué)

2、院提供的人重組FGF21蛋白注射2型糖尿病小鼠（T2D小鼠）14天，用血糖試紙檢測小鼠隨機(jī)血糖。再用Elisa法檢測小鼠胰島素水平。之后，在注射FGF211小時后，用血糖試紙檢測小鼠血糖。
　　結(jié)果:小鼠隨機(jī)血糖明顯下降并且增強(qiáng)了胰島素敏感性和降低了胰島素抵抗。注射FGF211小時后，T2D小鼠血糖和模擬應(yīng)激性高血糖小鼠血糖都明顯下降。
　　結(jié)論：FGF21可能也有快速降低血糖的作用。
　　第二部分 血清FGF21水平

3、對腦內(nèi)FGF21表達(dá)水平的影響
　　目的:有研究表明FGF21在患有心血管疾病、肝臟疾病、高血壓、肥胖、糖尿病等疾病時血清水平顯著增加?？赡艿臋C(jī)制是機(jī)體是對FGF21的信號傳導(dǎo)發(fā)生了障礙，對FGF21的敏感性減弱，才使FGF21過量表達(dá)。非常重要一點(diǎn)是有研究表明FGF21可以穿過血腦屏障(BBB)。但同時有研究發(fā)現(xiàn)FGF21需要通過細(xì)胞上的穿膜蛋白β-Klotho才能與成纖維因子受體(FGFR)結(jié)合而激活受體，這使FGF21的作用

4、有組織選擇性。而FGF21是否能進(jìn)入大腦，大腦中是否有β-Klotho的表達(dá)和FGF21的受體激活機(jī)制還沒有研究。
　　方法:本實(shí)驗(yàn)用Elisa法檢測非高血糖小鼠(ND小鼠)和2型糖尿病高血糖小鼠(T2D) FGF21血清水平。用western blot檢測ND小鼠的T2D小鼠的全腦蛋白做中FGF21表達(dá)水平。用western blot檢測靜脈注射外源性FGF21至小鼠后，同的時間點(diǎn)小鼠大腦的不同部位的FGF21、pFGFR1和β

5、-Klotho的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:血清中FGF21在T2D小鼠中明顯高于ND小鼠。T2D小鼠大腦蛋白中的FGF21表達(dá)顯著性高于ND小鼠。靜脈注射外源性FGF21至小鼠后不同的時間點(diǎn)收集大腦蛋白，做western blot檢測，發(fā)現(xiàn)大腦不同部分FGF21的表達(dá)的和成纖維成長因子受體1(FGFR1)的磷酸化都發(fā)生了變化，并且檢測到了β-Klotho的表達(dá)。
　　結(jié)論：表明了血清中FGF21的升高對大腦中FGF21的含量和F

6、GFR1受體的激活有影響。但腦中FGF21的含量升高除了外源性FGF21直接進(jìn)入，是否還存在被誘導(dǎo)升高尚不清楚;FGFR1的磷酸化是FGF21直接激活還是FGF21誘導(dǎo)了其他FGF家族的因子升高而激活的也尚不能定論，但由于檢測到了β-Klotho的表達(dá)，也有可能可以直接激活受體。這一結(jié)果表明FGF21可以穿過血腦屏障進(jìn)入大腦，也許可以直接作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生作用。
　　第三部分 FGF21對腦內(nèi)皮細(xì)胞的影響
　　目的:神經(jīng)

7、保護(hù)不局限于神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)，對血腦屏障的保護(hù)也非常關(guān)鍵。血清中升高的FGF21直接接觸到血管內(nèi)皮細(xì)胞，但FGF21對血管內(nèi)皮細(xì)胞是否有保護(hù)作用目前以及保護(hù)機(jī)制沒有研究。在血管內(nèi)皮中FGF21的表達(dá)和損傷后的表達(dá)變化，傳導(dǎo)通路和作用機(jī)制，以及受體復(fù)合物形式都有待研究。
　　方法:本研究應(yīng)用Western blot檢測FGF21在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)，缺氧缺糖(OGD)4小時再復(fù)氧復(fù)糖20小時候后FGF21的表達(dá)變化，以及血管內(nèi)皮細(xì)

8、胞被重組FGF21蛋白處理后磷酸化FGFR1和β-Klotho的表達(dá)變化，是否對FGF21有時間依賴和劑量依賴。使用RNA干擾(SiRNA)技術(shù)，轉(zhuǎn)染FGF21SiRNA后用Western blot檢測分析，以確認(rèn)血管內(nèi)皮中FGF21細(xì)胞中的表達(dá)。轉(zhuǎn)染β-Klotho SiRNA后用Western blot和免疫熒光來觀察在β-Klotho基因沉默后，F(xiàn)GFR1能否被FGF21激活以及FGF21/磷酸化FGFR1/β-Klotho在血管

9、內(nèi)皮細(xì)胞上是否共定位。用MTT檢測外源性FGF21能否對腦血管內(nèi)皮細(xì)胞在OGD4小時復(fù)糖復(fù)氧20小時的損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。用FITC檢測高糖炎癥損傷下FGF21對內(nèi)皮細(xì)胞滲透性保護(hù)。用western blot檢測FGF21通過誘導(dǎo)哪個蛋白升高來進(jìn)行保護(hù)作用。
　　結(jié)果:首次發(fā)現(xiàn)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中FGF21有表達(dá)且能被細(xì)胞缺氧缺糖后再灌注損傷誘導(dǎo)表達(dá)增加。FGF21在腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中能激活FGFR1磷酸化并同時誘導(dǎo)β-Klotho表達(dá)增

10、高，且FGF21/磷酸化FGFR1/β-Klotho這三者是在細(xì)胞是是共定位的。但在β-Klotho基因沉默后FGF21不能激活FGFR1。這一結(jié)果說明了在除了脂肪細(xì)胞，在腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中， FGF21的傳導(dǎo)通路也是通過FGF21/FGFR1/β-Klotho三聚體復(fù)合物的形成，激活FGFR1磷酸化而進(jìn)行信號傳導(dǎo)的。
　　結(jié)論：這是首次發(fā)現(xiàn)FGF21在非脂肪細(xì)胞組織，在腦內(nèi)皮細(xì)胞中也是通過FGF21/FGFR1/β-Klotho三

11、聚體復(fù)合物進(jìn)行信號傳導(dǎo)的，提示這也許是FGF21信號傳導(dǎo)的共性。并且外源性FGF21對腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的缺氧缺糖后再灌注損傷和高糖合并炎癥損傷都有保護(hù)作用。FGF21還對內(nèi)皮細(xì)胞在高糖合并炎癥損傷下減少其通透性的保護(hù)作用，其作用是通過誘導(dǎo)升高PPARγ實(shí)現(xiàn)的。FGF21還可以升高細(xì)胞膜連接蛋白ZO-1、VE-Cadherin連減少細(xì)胞通透性。
　　第四部分:FGF21對神經(jīng)元細(xì)胞的影響
　　目的:之前的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了FGF21能穿

12、過血腦屏障，而神經(jīng)元作為最重要的神經(jīng)功能性細(xì)胞，F(xiàn)GF21對神經(jīng)元細(xì)胞能否產(chǎn)生保護(hù)作用還沒有研究。并且FGF21在神經(jīng)元細(xì)胞中有無表達(dá)，或能否對FGF21的刺激產(chǎn)生反應(yīng)，以及FGF21在神經(jīng)元細(xì)胞的受體和信號傳導(dǎo)通路是什么。都還有待研究。
　　方法:本研究應(yīng)用Western blot檢測分析小鼠原代培養(yǎng)大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞正常情況下和缺氧后的FGF21表達(dá)變化，和小鼠原代培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞被重組FGF21蛋白處理后磷酸化纖維生長因子受體

13、1(FGFR1)和β-Klotho的表達(dá)變化，是否對FGF21有時間依賴和劑量依賴。用免疫熒光染色檢測磷酸化FGFR1和β-Klotho能否被FGF21誘導(dǎo)和是否與FGF21共定位。用Co-IP和Western blot檢測分析FGF21是否能與FGFR1和β-Klotho形成三聚體復(fù)合物。用LDH檢測外源性FGF21蛋白能否對小鼠原代培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞缺氧或高糖損傷時產(chǎn)生保護(hù)作用。
　　結(jié)果:小鼠原代培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞正常情況下FGF2

14、1的表達(dá)量極低，但在缺氧損傷后FGF21能被誘導(dǎo)表達(dá)增加。在小鼠原代培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞中可以看到FGF21/磷酸化FGFR1/β-Klotho是共定位的，且FGFR1被FGF21激活磷酸化。在小鼠原代培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞正常狀態(tài)下，F(xiàn)GF21表達(dá)量太低，并不會形成FGF21/FGFR1/β-Klotho三聚體復(fù)合物，F(xiàn)GFR1/β-Klotho也不會形成二聚體復(fù)合物。但小鼠原代培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞被重組FGF21蛋白處理后，可以觀測到FGF21/FGF