通過制備小鼠單克隆抗體篩選和研究胚胎干細胞標志物.pdf

1、ES細胞及其體外分化模型能夠模擬胚胎正常發(fā)育進程，在發(fā)育生物學、轉基因動物的生產(chǎn)、克隆動物、動物和人類疾病模型的建立、藥物的開發(fā)和篩選、基因治療、細胞組織和器官的修復和移植治療等方面都有廣泛的應用前景。目前常用于胚胎干細胞鑒別及質(zhì)量控制的表面標記主要有糖脂類SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4以及蛋白多糖類TRA-1-60、TRA-1-81、GCTM2等，這些表面標記最初是通過畸胎瘤或胚胎免疫獲得單克隆抗體后篩選得到的。OCT4、N

2、ANOG等轉錄因子的標志物抗體則直接使用蛋白作為免疫原免疫動物所獲得的。然而這些標志物的特異性有一定的局限性:它們在一些成體干細胞、正常組織或癌細胞中也有一定表達，胚胎干細胞特異性的膜表面標志數(shù)量更是有限。因此發(fā)現(xiàn)新的ES細胞功能性分子及特異性標志物至關重要。
　　本研究利用小鼠單克隆抗體技術篩選蛋白質(zhì)組學提示的候選標志物分子，從100余個未經(jīng)功能注釋的hES新膜表面蛋白挑選30個，表達重組蛋白，免疫BALB/c小鼠，通過WB篩選

3、陽性克隆，獲得一組針對重組蛋白陽性的小鼠單克隆抗體組。再通過hES的ICC染色鑒定，獲得9個hES染色陽性的抗體。通過ICC免疫熒光染色和IHC組織芯片的檢測方法，發(fā)現(xiàn)GRAMD1A蛋白特異性表達于多種上皮細胞，可以作為一種新的廣泛性上皮細胞標志物，在再生醫(yī)學和腫瘤診斷上是非常有價值的。
　　接著，我們利用小鼠單克隆抗體反向篩選mES標志物。將小鼠胚胎干細胞（全細胞）免疫BALB/c小鼠，通過ICC篩選，獲得大量針對小鼠胚胎干細胞

4、染色陽性的雜交瘤。其中6個單克隆抗體針對mESC染色較為特異，并通過流式分析進一步確定了這6個抗體對應的抗原隨著mESC的自發(fā)分化都有顯著下降。然后采用免疫共沉淀的方法純化抗原，通過質(zhì)譜檢測鑒定到其中一個蛋白是核仁磷酸蛋白(nucleophosmin，NPM)。最近有研究發(fā)現(xiàn)，NPM/B23對于胚胎發(fā)育和維持基因組穩(wěn)定性是必需的，NPM1基因失活可導致無限制的中心體復制和基因組失穩(wěn)。本研究的實驗結果顯示，NPM1廣泛分布于成體組織，且在

5、大部分的腫瘤細胞上高表達，隨著ES的自發(fā)分化表達量下降，與已有的文獻結果相符合?？贵wB3-C1針對的抗原特異性表達于未分化的mES，免疫組織化學染色結果顯示其主要表達于睪丸的初級精母細胞和子宮的子宮內(nèi)膜細胞，很可能是一種新的干細胞特異性標志物。雖然目前還無法鑒定其對應的蛋白，但是這個抗體作為于細胞鑒定的一種工具還是非常有意義的。
　　Zinc finger and SCAN domain-containing4(Zscan4)基因

6、最初被鑒定是在小鼠著床前胚胎的二細胞期特異性表達。Zscan4在小鼠ES細胞里的表達是瞬時、可逆的。其特有的表達模式表現(xiàn)為，只有1-5％的ES細胞在同一時間表達該基因。在小鼠胚胎干細胞中敲除基因Zscan4后，小鼠胚胎干細胞的ALT過程被抑制，細胞端粒長度在六代內(nèi)下降了30％。同時，胚胎干細胞的核型正常率由88％下降到65％，細胞分裂逐漸停滯，凋亡細胞的比例顯著上升。Zscan4基因?qū)τ陂L期維護mES細胞潛能起著積極作用。根據(jù)這個提示，