阿法替尼逆轉(zhuǎn)ABCB1轉(zhuǎn)運體介導(dǎo)的卵巢癌化療多藥耐藥性及其作用機制研究.pdf

1、目的：
　　本課題擬通過研究阿法替尼對ABCB1轉(zhuǎn)運體介導(dǎo)的卵巢癌化療MDR的影響及其作用機制，探究阿法替尼作為MDR逆轉(zhuǎn)劑的潛力，進一步揭示TKIs類藥物調(diào)控ABCB1轉(zhuǎn)運體的機制，比較非可逆性TKIs類藥物相較于可逆性TKIs類藥物在逆轉(zhuǎn)ABCB1轉(zhuǎn)運體介導(dǎo)的MDR作用方面的差異及優(yōu)勢。
　　方法：
　　采用MTT法考察阿法替尼對卵巢癌細胞的細胞毒性及其逆轉(zhuǎn)耐藥卵巢癌細胞MDR的作用;通過siRNA干擾技術(shù)敲低卵巢

2、癌細胞內(nèi)ABCB1轉(zhuǎn)運體的表達水平，驗證阿法替尼逆轉(zhuǎn)MDR的作用與ABCB1轉(zhuǎn)運體的相關(guān)性;應(yīng)用AnnexinⅤ-FITC/PI染色結(jié)合流式細胞術(shù)及TUNEL實驗，分別在體外及體內(nèi)水平考察阿法替尼對紫杉醇誘導(dǎo)的耐藥卵巢癌細胞凋亡的影響;通過裸鼠移植瘤實驗考察阿法替尼體內(nèi)水平逆轉(zhuǎn)卵巢癌MDR的作用;采用羅丹明123蓄積實驗、藥物體外轉(zhuǎn)運實驗、小動物活體成像實驗及ATPase活性實驗考察阿法替尼對ABCB1轉(zhuǎn)運體功能的影響及其機制;通過we

3、stern blot、RT-PCR、免疫組化、組織免疫熒光、細胞免疫熒光等實驗評價阿法替尼對ABCB1轉(zhuǎn)運體表達的影響并探究其機制;利用藥效團模型考察阿法替尼抑制ABCB1轉(zhuǎn)運體的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ);通過同源建模及分子對接實驗探究阿法替尼與ABCB1轉(zhuǎn)運體相互作用的結(jié)合模式;應(yīng)用基因測序技術(shù)考察阿法替尼逆轉(zhuǎn)ABCB1轉(zhuǎn)運體介導(dǎo)的MDR的作用是否涉及特定基因位點的突變。
　　結(jié)果：
　　1.阿法替尼體外水平逆轉(zhuǎn)ABCB1介導(dǎo)的卵巢癌化療

4、MDR
　　紫杉醇對敏感株A2780及耐藥株A2780T細胞的半數(shù)抑制濃度值(IC50)分別為0.039±0.003μM及198.92±14.85μM;阿霉素對敏感株A2780及耐藥株A2780T細胞的IC50分別為1.17±0.06μM及27.69±2.11μM;紫杉醇對敏感株SKOV3及耐藥株SKOV3-DDP細胞的IC50分別為0.033±0.002μM及41.79±3.67μM;阿霉素對敏感株SKOV3及耐藥株SKOV3-

5、DDP細胞的IC50分別為0.97±0.07μM及18.13±1.54μM。以上敏感株與耐藥株對化療藥物的敏感性差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，表明本實驗中所采用的兩種耐藥株細胞相較于兩種敏感株細胞，對ABCB1轉(zhuǎn)運體底物性化療藥物紫杉醇及阿霉素具有高度的耐藥性。
　　敲低A2780T及SKOV3-DDP細胞內(nèi)ABCB1轉(zhuǎn)運體的表達水平，可顯著降低紫杉醇及阿霉素對A2780T及SKOV3-DDP細胞的IC50(P＜0.01)

6、。聯(lián)用阿法替尼可進一步顯著降低紫杉醇及阿霉素對A2780T/ABCB1-及SKOV3-DDP/ABCB1-的IC50(P＜0.01)。
　　2.阿法替尼體內(nèi)水平逆轉(zhuǎn)ABCB1介導(dǎo)的MDR
　　對照組、紫杉醇組、阿法替尼組及阿法替尼與紫杉醇聯(lián)用組腫瘤平均重量分別為0.707±0.229 g、0.655±0.289g、0.247±0.088 g及0.113±0.079 g。阿法替尼與紫杉醇聯(lián)用不僅顯著延緩了荷瘤裸鼠背部A2780

7、T細胞異種移植瘤的生長，抑制率為84.02％，而且顯著誘導(dǎo)了腫瘤壞死及腫瘤退行性生長。
　　3.阿法替尼體內(nèi)外水平均可顯著增強紫杉醇誘導(dǎo)的耐藥卵巢癌細胞的凋亡作用
　　阿法替尼體外水平可濃度依賴性的顯著增加紫杉醇誘導(dǎo)的卵巢癌A2780T及SKOV3-DDP細胞的凋亡率(P＜0.01)。此外，體內(nèi)TUNEL實驗結(jié)果顯示，阿法替尼與紫杉醇聯(lián)用組裸鼠腫瘤組織鏡下可見大量陽性染色的細胞核，且核破裂及核溶解的細胞比例增加，表明該組腫瘤

8、組織發(fā)生了顯著的細胞壞死。
　　4.阿法替尼可通過抑制ABCB1轉(zhuǎn)運體的外排功能，進而增加羅丹明123在A2780T細胞內(nèi)的蓄積。此外，阿法替尼及紫杉醇均可激活A(yù)BCB1轉(zhuǎn)運體的ATPase活性。激活50％的ABCB1轉(zhuǎn)運體的ATPase活性所需的紫杉醇及阿法替尼的濃度分別為70.1μM及2.5μM。
　　5.阿法替尼通過抑制NF-κB通路的激活進而下調(diào)ABCB1轉(zhuǎn)運體的表達
　　阿法替尼可濃度依賴性的顯著抑制ABCB

9、1高表達的卵巢癌A2780T及SKOV3-DDP細胞內(nèi)ABCB1轉(zhuǎn)運體的蛋白表達水平及MDR1基因的mRNA水平，而可逆性的TKIs類藥物拉帕替尼不具有此作用。阿法替尼也可下調(diào)接種A2780T細胞獲得的荷瘤裸鼠腫瘤組織內(nèi)ABCB1轉(zhuǎn)運體的蛋白表達水平。此外，NF-κB抑制劑PDTC及NF-κB亞基p65特異性的siRNA均能下調(diào)A2780T細胞內(nèi)ABCB1轉(zhuǎn)運體的表達水平。此外，阿法替尼可顯著降低A2780T細胞胞漿及胞核內(nèi)NF-κB亞

10、基p65的表達水平，同時也可顯著抑制IκBα的磷酸化及降解。與NF-κB的抑制劑PDTC作用相似，阿法替尼可下調(diào)A2780T細胞內(nèi)基礎(chǔ)的核p65水平及抑制LPS誘導(dǎo)的p65的核轉(zhuǎn)位。上述結(jié)果表明阿法替尼可通過抑制NF-κB通路的激活，進而下調(diào)耐藥卵巢癌細胞內(nèi)ABCB1轉(zhuǎn)運體的表達。
　　6.阿法替尼逆轉(zhuǎn)ABCB1轉(zhuǎn)運體介導(dǎo)的卵巢癌MDR的作用與抑制MAPK/p38通路相關(guān)
　　已有研究報道通過抑制EGFR下游的MAPK通路可

11、部分逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性。阿法替尼可濃度依賴性的抑制A2780T細胞內(nèi)EGFR、HER-2及p38的磷酸化，而對EGFR、HER-2及p38的總蛋白表達水平?jīng)]有顯著影響。此外，阿法替尼對A2780T細胞內(nèi)JNK及ERK1/2的總蛋白及磷酸化蛋白表達水平均沒有顯著影響。p38及AKT是NF-κB通路的上游調(diào)節(jié)蛋白，該結(jié)果表明阿法替尼可通過抑制EGFR及HER-2的磷酸化，進而下調(diào)其下游的MAPK/p38及PI3K/AKT通路，抑

12、制NF-κB通路的激活，起到下調(diào)ABCB1轉(zhuǎn)運體表達的作用。
　　7.本研究中阿法替尼逆轉(zhuǎn)ABCB1轉(zhuǎn)運體介導(dǎo)的卵巢癌MDR的作用不涉及EGFR酪氨酸激酶區(qū)域的突變
　　超過90％的EGFR突變發(fā)生在EGFR受體的酪氨酸激酶區(qū)域，該區(qū)域由EGFR基因的18-21號外顯子編碼。測序結(jié)果顯示，卵巢癌敏感株(A2780及SKOV3)及耐藥株(A2780T及SKOV3-DDP)細胞內(nèi)EGFR基因的18-21號外顯子均為野生型，未發(fā)生

13、突變，表明本研究中阿法替尼逆轉(zhuǎn)ABCB1轉(zhuǎn)運體介導(dǎo)的卵巢癌MDR的作用不涉及EGFR酪氨酸激酶區(qū)域的突變。
　　8.阿法替尼作為ABCB1轉(zhuǎn)運體抑制劑的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)
　　選擇性的ABCB1轉(zhuǎn)運體抑制劑應(yīng)具有5個藥效團特征，包括1個芳香環(huán)、1個疏水中心和3個氫鍵受體。阿法替尼與ABCB1轉(zhuǎn)運體抑制劑的藥效團模型匹配性極佳。阿法替尼分子結(jié)構(gòu)中的苯環(huán)與藥效團模型中的芳香環(huán)相對應(yīng);阿法替尼分子結(jié)構(gòu)中的氟原子及其相連的苯環(huán)構(gòu)成了疏水中心，

14、與藥效團模型中的疏水中心相對應(yīng);阿法替尼分子結(jié)構(gòu)中的3個氧原子與藥效團模型中的3個氫鍵受體相對應(yīng)。因此，阿法替尼具有ABCB1轉(zhuǎn)運體抑制劑的藥效團特征。
　　9.阿法替尼與ABCB1轉(zhuǎn)運體之間的結(jié)合模式
　　分子對接實驗結(jié)果表明阿法替尼與人ABCB1轉(zhuǎn)運體有2個結(jié)合域，包括1個底物結(jié)合域和1個ATP結(jié)合域。阿法替尼與ABCB1轉(zhuǎn)運體的ATP結(jié)合域及底物結(jié)合域的結(jié)合能分別是-14.05 kcal/mol及-14.09 kcal

15、/mol。阿法替尼與ABCB1轉(zhuǎn)運體的ATP結(jié)合域的相互作用包括3個氫鍵和一個H-π作用。其中，阿法替尼分子結(jié)構(gòu)中的四氫呋喃環(huán)上的氧原子與ABCB1轉(zhuǎn)運體的Gly533及Gly534兩個位點形成2個氫鍵;分子結(jié)構(gòu)中的的叔胺基與ABCB1轉(zhuǎn)運體的Lys536位點形成1個氫鍵;分子結(jié)構(gòu)中的含N雜環(huán)與ABCB1轉(zhuǎn)運體中的Ala560位點形成1個H-π作用。測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人正常LO2細胞、未處理的卵巢癌敏感株、耐藥株細胞及阿法替尼給藥后的卵巢癌

16、敏感株、耐藥株細胞在這4個位點均未發(fā)生突變，表明本研究中阿法替尼逆轉(zhuǎn)ABCB1轉(zhuǎn)運體介導(dǎo)的卵巢癌MDR的作用不涉及該4個結(jié)合位點的突變。
　　結(jié)論：
　　阿法替尼體內(nèi)外水平均可顯著逆轉(zhuǎn)ABCB1轉(zhuǎn)運體介導(dǎo)的卵巢癌化療的MDR。與可逆性的TKIs類藥物不同，首個不可逆性的TKIs類藥物阿法替尼逆轉(zhuǎn)ABCB1轉(zhuǎn)運體介導(dǎo)的MDR的作用具有雙模式:即阿法替尼不僅可抑制ABCB1轉(zhuǎn)運體的外排功能并激活其ATPase活性，還可通過下調(diào)M

17、APK/p38及PI3K/AKT通路，進而抑制NF-κB通路的激活及MDR1基因的轉(zhuǎn)錄活性，下調(diào)ABCB1轉(zhuǎn)運體的表達。此外，除作用于ABCB1轉(zhuǎn)運體的底物結(jié)合域外，阿法替尼還可能與ABCB1轉(zhuǎn)運體的Gly533，Gly534，Lys536及Ala560四個位點形成氫鍵，進而作用于ABCB1轉(zhuǎn)運體的ATP結(jié)合域。且本研究中阿法替尼逆轉(zhuǎn)ABCB1轉(zhuǎn)運體介導(dǎo)的卵巢癌MDR的作用不涉及上述4個結(jié)合位點的突變及EGFR酪氨酸激酶區(qū)域的突變。本研