甾體化合物ASC26對ABCB1介導的腫瘤細胞耐藥性的逆轉作用及其機制研究.pdf

1、多藥耐藥性的產生，是導致腫瘤化療失敗的主要因素。研究報道ABC轉運體在腫瘤耐藥中發(fā)揮著重要作用，ABC轉運體家族成員之一的ABCB1，是最早發(fā)現(xiàn)的ABC轉運體，ABCB1的過表達是導致腫瘤耐藥性產生的關鍵因素之一。尋找高效低毒的ABCB1選擇性抑制劑已成為科研工作者的研究熱點。本課題利用ABCB1過表達的腫瘤耐藥細胞株，對一系列甾體衍生物進行了逆轉耐藥活性研究，旨在篩選出高效低毒的ABCB1選擇性抑制劑，并研究其逆轉耐藥的作用機制，為解

2、決腫瘤耐藥性問題提供研究模型。具體研究內容如下：
　　1.以ABCB1過表達的結腸癌耐阿霉素SW620/Ad300細胞株為基礎，建立逆轉劑篩選平臺，采用MTT法對一系列甾體衍生物進行篩選，旨在尋找高效低毒的耐藥逆轉劑。結果表明，新型甾體化合物ASC26在濃度為5μM時能顯著逆轉ABCB1調控的耐藥，并且對細胞的抑制率僅為7.39％。
　　2.利用MTT法評價ASC26對七對腫瘤耐藥及其親本細胞的增殖抑制作用，結果發(fā)現(xiàn)ASC2

3、6在8μM時，對這七對腫瘤耐藥及親本細胞的抑制率均小于15%，即沒有細胞毒性。
　　3.進一步研究 ASC26在濃度為8μM時的體外逆轉耐藥活性。結果表明， ASC26能使高表達ABCB1的腫瘤耐藥細胞對紫杉醇（ABCB1的底物）的敏感性顯著增加，而對順鉑（非ABCB1的底物）的抗腫瘤活性則無明顯影響。此外，對于ABCG2過表達的耐藥細胞，ASC26未表現(xiàn)出逆轉耐藥的作用。
　　4.利用高效液相法檢測ASC26對ABCB1高

4、表達的腫瘤耐藥細胞及其親本細胞內紫杉醇蓄積和外排的影響。結果發(fā)現(xiàn)，ASC26能顯著增加紫杉醇在ABCB1高表達的腫瘤耐藥細胞中的蓄積，抑制ABCB1高表達的腫瘤耐藥細胞對紫杉醇的外排，提高細胞內紫杉醇含量，而對親本腫瘤細胞內紫杉醇的蓄積和外排無明顯作用。
　　5.流式細胞術檢測ASC26對ABCB1高表達的SW620/Ad300細胞內羅丹明（Rho123）蓄積的影響。結果表明，ASC26能顯著增加 SW620/Ad300細胞內Rh

5、o123的滯留率，但對親本SW620細胞內Rho123的蓄積無明顯影響。
　　6.免疫熒光檢測ASC26對SW620/Ad300細胞內ABCB1轉運蛋白表達位點的影響。ASC26作用于SW620/Ad300細胞72 h后，免疫熒光法檢測ASC26對ABCB1表達位點的作用。結果表明， ASC26不改變細胞內ABCB1的蛋白表達位點。
　　8.利用Western blot檢測ASC26對ABCB1蛋白表達水平的影響。由West

6、ern blot結果可知， ASC26分別作用于SW620/Ad300耐藥細胞0 h，24 h，48 h，72 h后，并不改變細胞內ABCB1的蛋白表達水平。
　　9.分子對接實驗研究ASC26與人同源ABCB1分子模型的相互作用關系。分子對接實驗表明，化合物 ASC26能結合在 ABCB1轉運蛋白的跨膜結構域的藥物結合口袋上，從而抑制ABCB1對化療藥物的外排轉運。
　　本課題發(fā)現(xiàn)了一個選擇性ABCB1抑制劑，新型甾體化合

7、物ASC26，在無毒濃度下，能顯著逆轉ABCB1介導的腫瘤耐藥。進一步的機制研究表明， ASC26的逆轉耐藥機制是通過抑制 ABCB1轉運泵的外排轉運功能，而不是通過影響ABCB1的蛋白表達來發(fā)揮逆轉耐藥作用。ASC26能與ABCB1轉運蛋白的跨膜結構域的藥物結合口袋結合，抑制ABCB1對抗腫瘤藥物的外排作用，增加細胞內抗腫瘤藥物的濃度，從而提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，達到逆轉腫瘤耐藥的效果。這一研究成果將為解決腫瘤耐藥性問題提供新