蚯蚓纖溶酶基因多態(tài)性分析和各組分克隆產(chǎn)物的活性比較.pdf

1、蚯蚓蛋白水解酶（earthworm protease，EP）是一類在蚯蚓體內分離到的具有纖溶酶活性和激活纖溶酶原作用的蛋白水解酶。因具有抗凝、纖溶和溶栓作用，可以作為溶栓藥物治療因血栓引起的各種疾病，因此也習慣被稱為蚯蚓纖溶酶（earthworm fibrinolytic enzymes，EFE）。實驗證明，不同實驗室因取材或分離純化手段不同，獲得的組分也各不相同，但按照純化的天然EP組分的蛋白N-末端序列保守性和抗原特異性，可以將EP

2、大致分為四組，即P-0、P-Ⅰ、P-Ⅱ和P-Ⅲ。
　　 為了解該酶多組分的結構基礎，本研究利用生物信息學數(shù)據(jù)庫以及BLAST和DNAman軟件，對已報道的27條EFE基因和Lumbricidae的dbEST進行分析，證明EFE基因具有多態(tài)性。與此同時，在已獲得各組基因的基礎上，對EFE克隆表達產(chǎn)物的活性差異進行了分析，為其生物化學、藥理分析和生物工程方面的研究提供了參考資料。具體研究內容如下：
　　 1.根據(jù)純化的天然E

3、FE的N-末端序列信息，本研究在NCBI上進行BLAST，分別建立了P-0、P-Ⅰ和P-Ⅱ三組的EST數(shù)據(jù)庫，利用DNAman進行拼接得到了若干條新序列。同源性證明，P-0和P-Ⅰ兩個組的電子克隆產(chǎn)物與已報道的基因序列有差異，并分屬于P-0兩個亞組和P-Ⅰ四個亞組。
　　 2.P-Ⅲ組基因多態(tài)性分析證明，該組具有三個亞組：P-Ⅲ-1、P-Ⅲ-2和P-Ⅲ-3。本研究利用P-Ⅲ組的蛋白質序列兩端保守性設計引物，經(jīng)RT-PCR構建了該

4、組基因的質粒（pUC18）文庫，并依據(jù)差異部分設計的中間引物，從文庫中篩選獲得Efp-Ⅲ-2基因。加上本實驗室原有的Efp-Ⅲ-1和Efp-Ⅲ-3基因，序列比對證明它們是蚯蚓體內P-Ⅲ組分基因多態(tài)性的表現(xiàn)，而且在Lumbricidae科中與蚓種無關。該結果首次報道了由一個實驗室從一個蚓種獲得P-Ⅲ組分的三個亞組序列，從實驗上驗證了EST數(shù)據(jù)庫中EFE基因多態(tài)性的結論。
　　 3.本研究在本實驗室前期工作的基礎上，分別將已構建好的