灌注式培養(yǎng)復(fù)方殼多糖組織工程皮膚流速及營養(yǎng)條件的初步研究.pdf

1、皮膚是人體最重要的防御屏障，但因其直接與外界環(huán)境接觸，也最易受到各種損傷和疾病的傷害從而導(dǎo)致皮膚缺損，除了常規(guī)療法外，可以使用組織工程皮膚來修復(fù)。復(fù)方殼多糖組織工程皮膚作為一個(gè)較理想的三維模型，一直采用傳統(tǒng)的靜態(tài)培養(yǎng)方式，雖然技術(shù)已較為成熟，仍面臨培養(yǎng)時(shí)間較長、工作量大、偶有污染等缺點(diǎn)。而新興的灌注式培養(yǎng)這一動態(tài)培養(yǎng)的方法可以避免諸多靜態(tài)培養(yǎng)無法避免的問題。目前已研制的灌注式培養(yǎng)模式有五層重疊式、MINUTH灌注式培養(yǎng)等方法，但是對培養(yǎng)

2、的細(xì)胞有較強(qiáng)的針對性，應(yīng)用相對局限，且培養(yǎng)出的細(xì)胞與靜態(tài)培養(yǎng)相比活力比較接近，優(yōu)勢并不是十分突出。我們在本次實(shí)驗(yàn)中使用的灌注設(shè)備是我們自行研制的疊層式生物反應(yīng)器，在進(jìn)一步改進(jìn)、優(yōu)化后以求能達(dá)到更好的細(xì)胞培養(yǎng)效果。通過初步采用灌注式培養(yǎng)方法培養(yǎng)了組織工程皮膚，采用不同灌注流速比較組織工程真皮的細(xì)胞增殖情況，研究不同營養(yǎng)濃度對組織工程皮膚形態(tài)結(jié)構(gòu)及細(xì)胞增殖凋亡的影響，為進(jìn)一步改善灌注培養(yǎng)條件提供更多依據(jù)，為灌注式培養(yǎng)在組織工程皮膚方面的深入

3、應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。
　　目的:
　　1、簡要分析、比較目前我們采用的灌注式培養(yǎng)器低流速與高流速流場的均勻性與剪切力。
　　2、研究不同灌注流速對組織工程皮膚真皮細(xì)胞增殖的影響，初步摸索出較適合組織工程真皮動態(tài)培養(yǎng)的灌注速度。
　　3、比較不同營養(yǎng)濃度對組織工程雙層皮膚形態(tài)結(jié)構(gòu)及細(xì)胞增殖凋亡的影響，摸索較適宜細(xì)胞生長的營養(yǎng)濃度條件。
　　方法:
　　1、利用計(jì)算流體動力學(xué)(Computational Fl

4、uid Dynamics，CFD)，采用兩相流模型進(jìn)行三維流場計(jì)算模擬，進(jìn)行流場均勻性與剪切力的分析。
　　2、酶消化分離青年男性包皮標(biāo)本獲得成纖維細(xì)胞，并進(jìn)行培養(yǎng)、傳代，使用第2代成纖維細(xì)胞構(gòu)建復(fù)方殼多糖組織工程真皮。在低流量(80ml/min)及高流量(800ml/min)的灌注速度條件下培養(yǎng)復(fù)方殼多糖組織工程真皮，用MTT法檢測兩個(gè)流速狀態(tài)下真皮細(xì)胞的存活和增殖情況，并做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　3、使用第2代角質(zhì)形成細(xì)胞構(gòu)建

5、含表真皮的復(fù)方殼多糖組織工程雙層皮膚。將其分別置于含40％及80％低糖DMEM的培養(yǎng)基下進(jìn)行灌注式培養(yǎng)，分別于5天及10天取材，進(jìn)行HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)，利用ki67檢測細(xì)胞增殖情況，TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)并作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　1、我們研制的灌注設(shè)備結(jié)構(gòu)在流量較低時(shí)（如80ml/min時(shí)），營養(yǎng)液速度、動靜壓、流場漩渦度、速度梯度、流場矢量等指標(biāo)能夠保證很好的均勻性。當(dāng)流量增大時(shí)，全場流速增大

6、，動靜壓也有不同程度增高，流場失去均勻性特性。
　　2、MTT的結(jié)果顯示隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，低流速灌注條件下組織工程真皮內(nèi)的MTT值隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加，提示真皮內(nèi)的活細(xì)胞數(shù)不斷增加，細(xì)胞處于持續(xù)增殖狀態(tài)。另外，低流速灌注培養(yǎng)下的細(xì)胞活力顯著高于靜態(tài)培養(yǎng)。而高流速灌注情況下的細(xì)胞活力較靜態(tài)培養(yǎng)差。
　　3、低流速灌注培養(yǎng)的組織工程皮膚細(xì)胞在HE染色下形態(tài)較好，真表皮雙層結(jié)構(gòu)清晰，表明在灌注培養(yǎng)下，組織工程皮膚仍能獲得較好

7、的營養(yǎng)供應(yīng)。
　　4、免疫組化檢測ki67的結(jié)果顯示:表皮和真皮內(nèi)的ki67陽性細(xì)胞數(shù)在80％濃度的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)都顯著高于40％濃度的DMEM培養(yǎng)基(P＜0.05)。與80％濃度培養(yǎng)5d相比，80％濃度培養(yǎng)10d時(shí)真皮層內(nèi)ki67陽性細(xì)胞數(shù)，顯著減少(P＜0.05)。
　　5、用TUNEL檢測培養(yǎng)基的濃度對雙層組織工程皮膚內(nèi)細(xì)胞凋亡的影響，經(jīng)統(tǒng)計(jì)，真皮和表皮內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)量表明40％濃度DMEM培養(yǎng)組顯著高于80％濃度