Candida kruseiSW2026羰基還原酶的分離純化及其因序列研究.pdf

1、立體選擇性氧化還原酶是一種用于手性化合物合成的重要生物催化劑,具有產(chǎn)物光學(xué)純度高,反應(yīng)條件溫和,環(huán)境友好等特點(diǎn)。目前已經(jīng)有超過(guò)200種微生物可以不對(duì)稱(chēng)還原羰基化合物用來(lái)合成手性醇。手性醇是具有高附加值手性化合物合成的關(guān)鍵中間體,被廣泛用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、食品等不同領(lǐng)域的多種功能性手性化合物的不對(duì)稱(chēng)合成。近些年隨著不同光學(xué)異構(gòu)體藥理作用研究的深入及醫(yī)藥監(jiān)管部門(mén)對(duì)市售外消旋藥物審批愈加嚴(yán)格,因此研究和開(kāi)發(fā)光學(xué)純度高的手性藥物正成為新藥入市的關(guān)鍵

2、和巨大的利潤(rùn)增長(zhǎng)點(diǎn)。利用生物催化技術(shù)來(lái)合成手性藥物及其中間體由于其特有的優(yōu)勢(shì)而受到更多的關(guān)注,成為近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的研究焦點(diǎn)。光學(xué)純(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯(R)-HPBE]是血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑等普利類(lèi)藥物合成的關(guān)鍵手性中間體?？唆斔辜俳z酵母Candida krusei SW2026可用于還原2-氧代-4-苯基丁酸乙酯(OPBE)生成(R)-HPBE。本研究對(duì)該菌體內(nèi)的關(guān)鍵立體選擇性羰基還原酶進(jìn)行分離純化、性質(zhì)研究以及基因序列

3、的研究,具有較好的現(xiàn)實(shí)意義和理論價(jià)值。
　　 從Candida krusei SW2026中分離得到了NADPH依賴(lài)型羰基還原酶。粗酶經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀(40-90％)、HiPrep DEAE FF離子交換層析、HiTrap Blue HP親和層析、SuperdexTM75分子篩層析后在SDS-PAGE上顯示為單一條帶,蛋白亞基的分子量為46kDa,通過(guò)分子篩層析檢測(cè)為單一洗脫峰,其表觀分子量為45.5 kDa。
　　 研

4、究了該羰基還原酶的酶學(xué)性質(zhì),發(fā)現(xiàn)該羰基還原酶催化還原反應(yīng)的最適溫度為30℃,最適還原反應(yīng)的pH為6.0,在pH4.5-7.0的酸性范圍內(nèi)仍能夠保持原來(lái)80％以上的活力。酶對(duì)底物OPBE的最大反應(yīng)速率Vmax是18.7μmol/(min-mg)、Km值是0.319 mmol/L,對(duì)輔酶NADPH最大反應(yīng)速率Vmax是14.9μmol/(min.mg)、Km值是0.306 mmol/L。該酶具有較高的底物特異性,對(duì)含有苯基的酮酯類(lèi)底物具有較

5、高的不對(duì)稱(chēng)還原活力。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)Mn2+、β-巰基乙醇、二硫蘇糖醇對(duì)該酶的酶活有不同程度的促進(jìn)作用;重金屬離子、能夠與還原性硫醇基團(tuán)結(jié)合的金屬離子、抑制劑、還原劑、有機(jī)溶劑和表面活性劑對(duì)酶活有抑制作用。利用該酶催化不對(duì)稱(chēng)還原OPBE生成(R)-HPBE,4 h后e.e.值和產(chǎn)率分別為100％和84％。經(jīng)LC-MS-MS分析比對(duì),酶蛋白中一個(gè)肽段的氨基酸序列在NADP-dependent isocitrate dehydrogenase中

6、的覆蓋率約為2.4％,因此,目的蛋白與NADP-dependent isocitrate dehydrogenase有一定的相似性。
　　 以Candida krusei SW2026基因組為模板,以蛋白測(cè)序結(jié)果為依據(jù)設(shè)計(jì)引物,PCR擴(kuò)增得到了目的基因的部分序列,將PCR產(chǎn)物連接pMD18-T載體并測(cè)序得到長(zhǎng)度為677 bp的基因序列,從該序列的第二個(gè)堿基開(kāi)始共編碼225個(gè)氨基酸。并通過(guò)NCBI中Blast比對(duì)初步驗(yàn)證了其正確性