宜昌市肺炎克雷伯桿菌MLST及其主要流行菌株致病機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：肺炎克雷伯桿菌為醫(yī)院感染、社區(qū)感染的常見(jiàn)條件致病菌。隨著細(xì)菌耐藥性的出現(xiàn)，肺炎克雷伯桿菌感染有著病情難以控制、發(fā)展迅速、嚴(yán)重者可引起敗血癥、膿毒血癥、甚至多器官功能衰竭導(dǎo)致患者死亡等特點(diǎn)。作為一種備受關(guān)注的院內(nèi)外感染的常見(jiàn)病原菌，宜昌市肺炎克雷伯桿菌的流行特點(diǎn)及其主要流行菌株致病性的相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。鑒于此，分離臨床菌株進(jìn)行基因分型、鑒定主要流行菌株及研究其致病機(jī)制對(duì)揭示宜昌市肺炎克雷伯桿菌的分子流行病學(xué)及其感染特點(diǎn)具有重要意義

2、。
　　材料與方法：在宜昌市肺炎克雷伯桿菌的MLST中，收集2014年11月1日至12月31日來(lái)自三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院三家附屬醫(yī)院臨床分離的肺炎克雷伯桿菌。臨床分離培養(yǎng)肺炎克雷伯桿菌后，用多位點(diǎn)序列分型技術(shù)（MLST，multilocus sequence types）確定肺炎克雷伯桿菌序列型，同時(shí)應(yīng)用eBURST3.0軟件對(duì)MLST結(jié)果進(jìn)行肺炎克雷伯桿菌種群結(jié)構(gòu)分析。在主要流行菌株致病機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究中，將60只健康的C57B6小鼠隨機(jī)

3、分組，建立皮膚感染模型及肺炎模型，每個(gè)感染模型取3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分為1個(gè)對(duì)照組及1個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組隨機(jī)選取5只小鼠。將適量流行菌株菌液注射小鼠右側(cè)腹部皮下組織建立皮膚感染模型，于感染后第1d、5d、10d取皮膚炎癥組織，通過(guò)HE染色觀察組織病理學(xué)變化，甲苯胺藍(lán)染色觀察肥大細(xì)胞的數(shù)量與分布及免疫組化檢測(cè)TNF-α、tryptase在皮膚炎癥部位的表達(dá)。同時(shí)，通過(guò)滴鼻建立肺炎克雷伯桿菌肺炎模型，于感染后第1 d、10 d、21 d取肺炎

4、組織，通過(guò)HE染色觀察肺炎組織病理學(xué)變化及免疫組化檢測(cè)TNF-α、tryptase、p65及NOS1在肺炎組織的表達(dá)。
　　結(jié)果：在宜昌市肺炎克雷伯桿菌MLST中，通過(guò)分離培養(yǎng)，鑒定到30株肺炎克雷伯桿菌。MLST將菌株分為17個(gè)ST，其中，ST23為5株，約占17％；ST412及ST753各3株，各占10%；ST60、ST895、ST340、ST392及ST25各2株，約各占7%；ST1049、ST268、ST722、ST173

5、、ST307、ST86、ST65、ST660及ST395各為1株。經(jīng)eBURST3.0分析將17個(gè)ST分為2個(gè)克隆群（ST340、ST895；ST65、ST25），1個(gè)CC23克隆復(fù)合體（ST23、ST25、ST60、ST65、ST86、ST268、ST340、ST395、ST412、ST660、ST722及ST895），其中ST173、ST307、ST392、ST753及ST1049為單個(gè)型。在ST23流行菌株致病機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究中，S

6、T23菌株可誘導(dǎo)皮膚組織的炎癥形成，與PBS對(duì)照組相比，感染組中炎性介質(zhì)TNF-α及tryptase表達(dá)明顯上調(diào)，免疫效應(yīng)細(xì)胞肥大細(xì)胞數(shù)量在炎癥區(qū)域顯著增加，圖像分析統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)與 PBS對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01或 P<0.001）；ST23菌株可誘導(dǎo)小鼠肺炎，與PBS對(duì)照相比，細(xì)菌感染組肺組織有明顯的組織病理學(xué)損傷與炎癥變化，免疫組化染色發(fā)現(xiàn)炎癥介質(zhì)TNF-α、NF-κB p65及NOS1在感染組肺組織的表達(dá)顯著