細胞因子增強膀胱上皮細胞對肺炎克雷伯桿菌的抗菌活性.pdf

1、上皮細胞是宿主與細菌相互接觸的前沿，除了物理屏障功能，上皮細胞通過產(chǎn)生細胞因子、化學因子、抗菌多肽等而成為宿主防御病原體感染的第一道防線。 肺炎克雷伯桿菌(Klebsiella pneumoniae，KP)是一種重要的條件致病菌，當機體免疫力低下時，能引起疾病的發(fā)生。從尿路到呼吸道，KP感染的發(fā)病率都很高，且在臨床上易反復發(fā)作。 KP感染上皮細胞的過程可分為識別、粘附、侵襲，當細菌與上皮細胞粘附時，啟動了上皮細胞的信號轉(zhuǎn)

2、導系統(tǒng)，細胞開始對粘附的細菌內(nèi)吞。與KP致病的相關因子，主要為莢膜抗原、粘附素如1型菌毛、LPS、抗血清反應系統(tǒng)以及鐵載體。機體的天然免疫通過模式識別受體(Pattenrecognition receptor，PRR)識別病原相關分子模式(Pathogen associatedmolecular pattens，PAMP)，誘導機體產(chǎn)生炎癥反應和免疫應答。TLR就是一類進化保守的胚系編碼的PRR，TLR4主要識別革蘭氏陰性菌的LPS。

3、 上皮細胞有復雜的免疫防御及炎癥反應機制，涉及一系列炎癥信號轉(zhuǎn)導和基因表達及調(diào)控機制。致病菌與上皮細胞長期接觸，形成了復雜的入侵與抗感染機制。一方面，細菌通過致病因子，包括粘附因子、侵襲因子、毒力因子入侵機體進行繁殖、擴增，導致疾病的發(fā)生。另一方面，宿主通過自身的防御機制，抵抗致病菌的入侵。上皮細胞不但能夠產(chǎn)生具有直接殺滅病原微生物的抗菌肽分子，還能夠產(chǎn)生調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應的細胞因子、趨化細胞因子，進一步激活其他炎癥和免疫細胞。本

4、研究的目的是通過細胞實驗模型，用兩株臨床分離的肺炎克雷伯桿菌(K5、03183)，與膀胱移型上皮細胞T24共同作用，觀察KP在T24細胞內(nèi)的動態(tài)變化。分別在不同的時間點用TritonX-100裂解細胞，釋放細胞內(nèi)的活菌，用平板菌落計數(shù)法，計數(shù)細胞內(nèi)的活菌數(shù)。結果表明，K5、03183在膀胱上皮細胞T24細胞內(nèi)有一定的生長趨勢，在48小時之后，細胞內(nèi)活菌數(shù)開始減少。說明膀胱上皮細胞有一定防御能力，可以清除細胞內(nèi)的KP。 TNF-α

5、、INF-γ、IL-1β是炎癥細胞因子，也是調(diào)節(jié)天然免疫的重要介質(zhì)。用K5、03183感染T24細胞，再加入TNFα和INF-γ與細胞作用，分別于細菌感染后的4小時、24小時裂解細胞，釋放出細胞內(nèi)的活細菌，用平板菌落計數(shù)法，計數(shù)胞內(nèi)活菌數(shù)。結果發(fā)現(xiàn)，TNF-α和INF-γ聯(lián)合作用能夠顯著促進T24細胞清除胞內(nèi)的KP。而。TNF-α與INF-γ共同作用于K5感染的T24細胞，分別于細菌感染后的4小時、12小時、24小時、48小時裂解細胞，

6、細胞因子組在24小時開始減少。 單獨使用不同濃度的TNF-α、INF-γ或IL-1β(5、10、20ng/ml)，分別于細菌感染后的4小時、24小時、48小時裂解細胞，結果發(fā)現(xiàn)，INF-γ促進T24細胞清除胞內(nèi)：KP的能力較TNF-α、IL-1β強。聯(lián)合使用INF-γ與IL-1β，或者聯(lián)合使用INF-γ加TNF-α，分別于K5感染。T24后的4小時、24小時、48小時裂解細胞，結果顯示INF-γ加、IL-1β組促進T24細胞清除

7、胞內(nèi)KP的能力不如INF-γ加TNF-α組。 吞噬細胞(比如中性粒細胞)在炎癥反應時發(fā)生“呼吸爆發(fā)”(respiratory brust)，產(chǎn)生大量活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS)。ROS包括O<,2><'->，·OH，NO等自由基物質(zhì)和H<,2>O<,2>，ONOO<'->，單線態(tài)氧(<'1>O2)等非自由基物質(zhì)，有很強的殺菌作用。T24細胞的殺菌機制是否與細胞內(nèi)的活性氧(ROS)和活性氮(R

8、NI)升高有關?實驗分別使用過氧化氫酶(CATA)及一氧化氮合酶抑制劑(L-NAME)，探討活性氧和活性氮是否與TNF-α和INF-γ刺激的膀胱上皮細胞抗菌作用相關。結果表明，使用過氧化氫酶(CATA)、L-NAME，細胞內(nèi)K5、03183的活菌數(shù)分別在4小時、24小時明顯增加，可見清除了細胞內(nèi)的H<,2>O<,2>以及NO，T24細胞殺菌能力下降。表明H<,2>O<,2>及NO是T24細胞抗菌作用的重要效應分子。本課題研究結果表明，膀