豬第一極體發(fā)育功能的研究.pdf

1、本試驗(yàn)以屠宰場(chǎng)廢棄的豬卵巢卵母細(xì)胞為試驗(yàn)材料，主要對(duì)有腔卵母細(xì)胞的采集、卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)、第一極體(PbI)的排出時(shí)間、保存、活性鑒定以及分離方法、PbI重組MⅡ期卵母細(xì)胞的顯微操作術(shù)、重組卵母細(xì)胞的體外受精(包括單精子胞質(zhì)內(nèi)顯微注射)及其受精卵體外發(fā)育培養(yǎng)等進(jìn)行了較系統(tǒng)的探索性研究，以期初步建立一整套豬PbI的分離、保存、重組、體外受精與體外發(fā)育的系統(tǒng)技術(shù)程序，為進(jìn)一步深入開展豬和其他動(dòng)物極體基因資源的研究及利用奠定基礎(chǔ)。取得主要

2、結(jié)果如下： 1.建立了豬卵巢卵母細(xì)胞體外成熟、體外受精及其胚胎體外發(fā)育培養(yǎng)系統(tǒng)與技術(shù)。探討了不同發(fā)育階段(直徑大小)卵泡卵母細(xì)胞、不同培養(yǎng)系統(tǒng)與添加成分以及不同培養(yǎng)時(shí)間等關(guān)鍵因素對(duì)豬卵母細(xì)胞WM的影響。實(shí)驗(yàn)證明，采用mTCM199作為基礎(chǔ)成熟培養(yǎng)系統(tǒng)液，并添加Φ5-8 mm卵泡液(pFF)和雌二醇(E2)，Φ2-8 mm卵巢卵泡COCs經(jīng)IVM40h可得到較高的成熟率和IVF后體外發(fā)育卵裂率。 2.建立了一套豬PbI保存

3、和活力(細(xì)胞化學(xué)與形態(tài)學(xué))鑒定的方法。分別對(duì)體外成熟培養(yǎng)過(guò)程中卵母細(xì)胞排出PbI規(guī)律、極體活性及其形態(tài)學(xué)變化進(jìn)行了觀察、分析與評(píng)價(jià)；發(fā)現(xiàn)卵泡卵母細(xì)胞IVM40h后可得到大量高活性PbI；39℃條件下大多數(shù)采集的PbI存活時(shí)間僅有4 h，4℃條件下保存40 h存活率可達(dá)85.0％；-20℃保存1 wk達(dá)95.0％，而超低溫冷凍長(zhǎng)期保存存活率和形態(tài)正常率分別達(dá)89.1％和97.8％。 3.利用顯微操作技術(shù)，建立了豬PbI的分離以及P

4、bI與卵母細(xì)胞重組的方法。Pbl分離后將其核物質(zhì)顯微注射入去核卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，重組卵母細(xì)胞。結(jié)果表明，顯微操作分離極體效果顯著優(yōu)于酶消化法，且分離的PbI活力高，完整性好；使用含CCB的DPBS操作液可以得到重組成功率達(dá)87.2％。 4.建立了豬新鮮和冷凍的PbI重組卵母細(xì)胞體外受精及其胚胎體外發(fā)育培養(yǎng)系統(tǒng)與技術(shù)，成功地獲得了豬重組卵母細(xì)胞體外受精后的2=細(xì)胞和4-細(xì)胞胚胎。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，新鮮和冷凍PbI重組卵母細(xì)胞后均可以進(jìn)一