GFP-HCMVIE1融合蛋白對巨噬細胞分泌功能與凋亡的影響.pdf

1、目的:構建人巨細胞病毒(HCMV)IE1蛋白與增強型綠色熒光蛋白EGFP融合蛋白真核細胞表達載體pEGFP-C1/IE1,將其轉染入THP-1巨噬細胞,初步探討GFP-HCMV IE1融合蛋白瞬時高表達對THP-1巨噬細胞分泌細胞因子活性及其凋亡的影響,為進一步研究IE1蛋白在HCMV致病機制中的作用奠定實驗基礎。
　　方法:
　　(1)用 HindⅢ和BamHⅠ雙酶切 pNEB193/IE1質粒,將 IE1基因片段亞克隆入

2、pcDNA3.1(+)載體,雙酶切鑒定及測序分析;SalⅠ和BamHⅠ雙酶切質粒pcDNA3.1(+)/IE1,然后將目的基因亞克隆入 pEGFP-C1,構建真核表達載體pEGFP-C1/IE1。
　　(2)將真核表達載體pEGFP-C1/IE1與pEGFP-C1分別轉染THP-1巨噬細胞,實驗分3組:巨噬細胞空白對照組(Control組);pEGFP-C1轉染巨噬細胞組(GFP組);pEGFP-C1/IE1轉染巨噬細胞組(GFP

3、-IE1組)。轉染48h后,通過Western-blotting和倒置熒光顯微鏡檢測GFP-HCMVIE1融合蛋白或GFP的表達與定位。
　　(3)利用ELISA分別檢測12h、24h、48h各組細胞培養(yǎng)上清中TNF-α和IL-1β的含量;采用RT-PCR檢測其mRNA的表達;收集巨噬細胞經PI染色后流式細胞術(FCM)檢測其凋亡率。
　　(4)利用統計軟件SPSS13.0分析實驗數據。
　　結果:
　　(1)

4、IE1基因亞克隆至pcDNA3.1(+)載體上后,經雙酶切及測序分析,所克隆的目的片段與 GenBank上公布的HCMV IE1基因序列完全一致,然后將目的片段亞克隆入pEGFP-C1中,雙酶切結果顯示構建了真核表達載體pEGFP-C1/IE1,且GFP-IE1融合蛋白在THP-1巨噬細胞內瞬時表達并定位于細胞核,GFP在整個細胞中均勻表達。Western-blotting結果表明在 THP-1巨噬細胞中表達了分子量約101.4kD的融

5、合蛋白。
　　(2)轉染12h時,GFP-IE1組培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1β含量明顯升高,隨著時間的遞增,2種細胞因子分泌量呈上升趨勢,與空白對照組或 GFP組比較差異有顯著性(P<0.01)。GFP瞬時表達對2種細胞因子的分泌影響差異無顯著性(P>0.05)。GFP-IE1組TNF-α和IL-1βmRNA表達水平均增加。
　　(3)轉染后48h,GFP-IE1組巨噬細胞凋亡率明顯升高,與空白對照組或GFP組比較差異有

6、顯著性(P<0.01),而GFP組巨噬細胞凋亡率與對照組比較差異無顯著性(P>0.05)。
　　結論:
　　(1)成功構建了真核表達載體 pEGFP-C1/IE1,且能在 THP-1巨噬細胞中表達GFP-HCMV IE1融合蛋白并定位于細胞核。
　　(2) GFP-HCMV IE1融合蛋白瞬時高表達上調THP-1巨噬細胞分泌TNF-α和IL-1β。
　　(3) GFP-HCMV IE1融合蛋白瞬時高表達誘導THP