人ATP2A3基因慢病毒shRNA載體質(zhì)粒的構建及鑒定.pdf

1、目的：構建人 ATP2A3基因慢病毒 shRNA載體并進行鑒定，為進一步探討鹽霉素通過調(diào)控ATP2A3基因抗腫瘤干細胞的機理研究提供實驗材料。
　　方法：1.構建4條ATP2A3基因慢病毒shRNA載體：將目的基因干擾序列連接到pGMLV-SC1 RNA干擾慢病毒載體后將其轉(zhuǎn)進細菌感受態(tài)細胞中，等生成單克隆菌落后行PCR測序鑒定，測序比對正確的克隆即為所需的ATP2A3基因 RNAi慢病毒載體。2.包裝慢病毒及測定病毒滴度：抽提高

2、純度、無內(nèi)毒素的慢病毒shRNA載體及其輔助包裝原件載體質(zhì)粒，使用HG transgene reagent將兩者共轉(zhuǎn)染到293T細胞，通過促轉(zhuǎn)染、換液、培養(yǎng)等處理后，獲取細胞上清液，進一步經(jīng)濃縮后獲得高滴度慢病毒濃縮液，在293T細胞中標定其病毒滴度。3.干擾載體對PC-3細胞內(nèi)ATP2A3的沉默評價：用包裝好的慢病毒以及慢病毒陰性對照感染靶細胞PC-3，感染成功后通過Western Blot和RT-PCR方法評價干擾載體對靶基因的干擾

3、效果。
　　結果：1.對構建好的4條慢病毒干擾載體經(jīng)PCR測序鑒定，DNA序列均無位點突變，證明質(zhì)粒構建成功。2.將構建好的慢病毒載體質(zhì)粒陽性克隆菌株轉(zhuǎn)染293T細胞后熒光顯微鏡下可見綠色熒光；在293T細胞中進行病毒包裝，最終純化出pGMLV-SC1-ATP2A3慢病毒顆粒，并測得其滴度為1*109 TU/ml。3.病毒感染靶細胞后，經(jīng)Western blot及RT-PCR驗證，4條shRNA均有一定的沉默，其中以ATP2A3-