淫羊藿素對(duì)MC3T3-E1 Subclone14 ER-MAPK信號(hào)通路的影響.pdf

1、目的：觀察淫羊藿素對(duì)前體成骨細(xì)胞株 MC3T3-E1Subclone14活力和分化的影響，研究淫羊藿素對(duì)于成骨細(xì)胞ER、MAPK信號(hào)通路和Runx2轉(zhuǎn)錄因子的影響，明確其作用于成骨細(xì)胞而影響骨代謝的具體靶點(diǎn)，為淫羊藿素治療骨質(zhì)疏松等骨代謝疾病提供分子學(xué)依據(jù)。
　　方法：
　　（1）CCK-8法檢測(cè)淫羊藿素對(duì)成骨細(xì)胞活力的影響；流式細(xì)胞儀檢測(cè)淫羊藿素對(duì)成骨細(xì)胞周期的影響；茜素紅染色和VON KOSSA染色檢測(cè)淫羊藿素對(duì)成骨細(xì)胞

2、礦化結(jié)節(jié)形成的影響；天狼星紅染色檢測(cè)淫羊藿素對(duì)成骨細(xì)胞膠原蛋白表達(dá)的影響。
　?。?）ALP試劑盒和 ELISA法分別檢測(cè)不同濃度淫羊藿素對(duì)成骨細(xì)胞ALP、Col I、OPN合成分泌的影響；QPCR檢測(cè)不同濃度淫羊藿素對(duì)成骨細(xì)胞ALP、Col I、OPN及轉(zhuǎn)錄因子Runx2 mRNA表達(dá)的影響。
　?。?）Western-blot檢測(cè)不同濃度淫羊藿素對(duì)成骨細(xì)胞p-ERK1/2、p-P38MAPK、p-JNK蛋白表達(dá)的影響；<

3、br>　?。?）5μM的ICI182780預(yù)處理30min，QPCR檢測(cè)淫羊藿素對(duì)成骨細(xì)胞ALP、Col I、OPN mRNA表達(dá)的影響；20μM的SB203580預(yù)處理30min，QPCR檢測(cè)淫羊藿素對(duì)成骨細(xì)胞ALP、Col I、OPN mRNA表達(dá)的影響；10μM的PD98059預(yù)處理30min，QPCR檢測(cè)淫羊藿素對(duì)成骨細(xì)胞ALP、Col I、OPN mRNA表達(dá)的影響。
　?。?）5μM的ICI182780預(yù)處理10min

4、，Western-blot檢測(cè)淫羊藿素對(duì)成骨細(xì)胞p-P38MAPK和p-ERK1/2蛋白表達(dá)的影響.。
　?。?）5μM的ICI182780預(yù)處理10min，免疫熒光檢測(cè)淫羊藿素對(duì)成骨細(xì)胞p-P38MAPK和p-ERK1/2蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　(1)不同濃度淫羊藿素干預(yù)細(xì)胞72h，CCK-8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)淫羊藿素（0.1μM、1μM、10μM）可以顯著提高細(xì)胞活力（P<0.05），且10μM效果最為顯著（P<0

5、.01）；與Control組比較，淫羊藿素（0.1μM、1μM、10μM）對(duì)細(xì)胞周期無顯著性影響（P>0.05）。
　　(2)與Control組比較，淫羊藿素（0.1μM、1μM、10μM）可以顯著的提高細(xì)胞ALP、Col I、OPN mRNA與蛋白的表達(dá)（P<0.05），其中10μM組效果最佳（P<0.01）；淫羊藿素（1μM、10μM）可以顯著的提高Runx2 mRNA的表達(dá)（P<0.05）。
　　(3)與Control

6、組比較，淫羊藿素（0.1μM、1μM、10μM）可以顯著提高P38MAPK蛋白的磷酸化，其中10μM組效果最佳（P<0.01）；淫羊藿素（1μM、10μM）可以顯著提高ERK1/2蛋白的磷酸化，其中10μM組效果最佳（P<0.01）；淫羊藿素（0.1μM、1μM、10μM）對(duì)JNK蛋白的磷酸化無顯著性影響（P>0.05）。
　　(4)分別加入ICI182780、SB203580和PD98059預(yù)處理后，與單獨(dú)使用藥物組比較，10μ

7、M的淫羊藿素促進(jìn)ALP、Col I、OPN mRNA表達(dá)的作用顯著性下降（P<0.01或0.05）。
　　(5)與Control組比較，10μM的淫羊藿素可以顯著性增強(qiáng)P38MAPK和ERK1/2的磷酸化（P<0.05）；加入ICI182780預(yù)處理后，與單獨(dú)使用藥物組比較，10μM淫羊藿素促進(jìn)P38MAPK和ERK1/2蛋白的磷酸化作用明顯減弱（P<0.01或0.05）。
　　結(jié)論：
　　（1）在一定濃度范圍內(nèi)，淫羊

8、藿素（0.1μM、1μM、10μM）對(duì) MC3T3-E1 Subclone14增殖無明顯的影響，但可以提高細(xì)胞的活力，且10μM的淫羊藿素效果最佳。
　?。?）在一定濃度范圍內(nèi)，淫羊藿素（0.1μM、1μM、10μM）可以促進(jìn)MC3T3-E1 Subclone14細(xì)胞的分化、成熟和礦化，且10μM的淫羊藿素效果最佳。
　?。?）在一定濃度范圍內(nèi)，淫羊藿素（0.1μM、1μM、10μM）可以激活ERK1/2、P38MAPK蛋白

9、，且10μM的淫羊藿素效果最佳；淫羊藿素不能活化JNK蛋白。
　?。?）分別阻斷ER、ERK1/2、P38MAPK信號(hào)通路，淫羊藿素對(duì)ALP、Col I、OPN mRNA表達(dá)的促進(jìn)作用顯著性下降，表明淫羊藿素可以通過 ER、ERK1/2、P38MAPK信號(hào)通路促進(jìn)MC3T3-E1 Subclone14的骨向分化。
　?。?）淫羊藿素能促進(jìn)MC3T3-E1 Subclone14細(xì)胞分化，且ER、ERK1/2、P38MAPK信號(hào)