白血病免疫分型細胞芯片捕獲細胞的免疫細胞化學研究.pdf

1、目的: 生物芯片誕生于上世紀90年代初，是近年來高新技術領域中極具時代特征的重大進展，是物理學、微電子學與分子生物學綜合交叉形成的高新技術。被廣泛應用于疾病診斷等多方面。目前，白血病的免疫分型診斷主要依靠用已知的單克隆抗體(McAb)去鑒定白血病細胞表面或胞漿抗原-CD抗原，根據(jù)不同抗原在不同階段的出現(xiàn)與消失，決定白細胞所屬的系列及分化階段，做出免疫學診斷。 本實驗室構建的白血病免疫學分型細胞芯片就是利用抗原、抗體特異性

2、結合的原理，將白細胞表面分化抗原單克隆抗體固定于載體上，形成抗體點陣。不同的單克隆抗體能夠自動識別和捕獲表達相應表面分化抗原的細胞，從而對白血病進行免疫學分型。這種對白血病進行免疫學分型的方法較免疫細胞化學和流式細胞儀檢測法具有高通量、使用簡便、樣品用量少、檢測速度快、靈敏度高、經(jīng)濟實用等優(yōu)點。 但是，白血病免疫分型細胞芯片作為一種新型的方法，需要傳統(tǒng)公認的免疫細胞化學技術和流式細胞術的驗證。另外，白血病免疫分型的檢測，需要細胞

3、表面抗原和胞漿抗原的檢測，尤其是在雙表型檢測及特殊表型的檢測時，胞內抗原的檢測更是十分重要的。澳大利亞悉尼大學醫(yī)學研究所的Larssa Belov等所研制的白血病免疫分型抗體微陣列，僅能檢測細胞表面分化抗原，而我們實驗室所研制的芯片以具有透明性的玻璃為載體，在表達相應CD抗原的白細胞與芯片上的抗體結合后，在其上用免疫細胞化學，來檢測胞漿內的分化抗原，將結果直觀、穩(wěn)定的表現(xiàn)出來，為臨床診斷提供更快速、簡便、完善、準確的白血病免疫分型診斷方

4、法。 方法: 1、確定芯片上捕獲細胞的最佳固定方法 制備細胞芯片，室溫條件下，分別用下列固定劑固定(1)甲醇：丙酮(1：1v/v)90秒；(2)95％乙醇3分鐘；(3)95％乙醇：冰醋酸(AA液95：5v/v)3分鐘；(4)AF液(95％乙醇：甲醛：水=68.4：10：21.6v/v)1分鐘。除AF液固定后用蒸餾水洗2遍外，其余固定劑固定后芯片自然風干。免疫細胞化學后顯微鏡下觀察點陣捕獲的細胞形態(tài)、抗原的表現(xiàn)情況

5、、細胞核復染著色情況及計數(shù)固定前后細胞數(shù)量。 2、確定細胞芯片上的免疫細胞化學所用單克隆抗體的最佳濃度 在相同條件下，細胞芯片上細胞用最佳固定方法固定，進行酶標免疫細胞化學，第一抗體抗CD7、抗CD13、抗CD19、抗MPO濃度分別為4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml，陰性對照滴加等量PBS，室溫下孵育1小時；DAB顯色，顯微鏡下觀察結果。 3、用免疫細胞化學法染色細胞

6、芯片捕獲細胞的胞膜及胞漿 抗原細胞芯片，用最佳方法固定，按1μg/ml最佳濃度稀釋免疫細胞化學第一抗體羊抗人抗CD7、抗CD13、抗CD19、抗MPO，陰性對照用PBS緩沖液代替第一抗體，免疫細胞化學染色后，顯微鏡下觀察結果。 4、檢測細胞芯片捕獲細胞的特異性 細胞芯片用最佳方法固定，按1μg/ml最佳濃度稀釋免疫細胞化學第一抗體抗CD7、抗CD13、抗CD19，陰性對照用PBS緩沖液代替第一抗體，進行免疫細胞化

7、學操作后，顯微鏡下每種抗體點上取三個高倍鏡視野，計數(shù)細胞總數(shù)和有棕色顆粒的陽性細胞數(shù)，計算陽性率。 5、應用細胞芯片進行白血病免疫分型并用免疫細胞化學法驗證特異性 制備應用于白血病免疫分型的細胞芯片，從白血病患者的外周血中提取白細胞，吖叮橙染色，孵育芯片，PBS清洗，掃描，檢測信號，得到白血病免疫分型結果。再用免疫細胞化學驗證。 結果: 1、細胞芯片捕獲細胞的固定方法以AF液(95％乙醇：甲醛：水=68.

8、4：10：21.6v/v)1分鐘最佳。 2、細胞芯片上的免疫細胞化學所用單克隆抗體的濃度以1μg/ml室溫下孵育1小時最佳。 3、細胞芯片上免疫細胞化學第一抗體為抗CD7、抗CD13、抗CD19時，棕色顆粒在細胞膜上；第一抗體為抗MPO時棕色顆粒在胞漿中。 4、細胞芯片的特異性捕獲陽性率在96.7±0.4％以上，非特異性捕獲陽性率在0.8±0.3％以下，具有明顯的特異性。 5、白血病細胞芯片的特異性捕獲陽

9、性率在97.4±0.2％以上，具有明顯的特異性。 結論： 1、白血病免疫分型芯片捕獲細胞的固定用AF液(95％乙醇：甲醛：水=68.4：10：21.6v/v)室溫下固定1分鐘最佳。 2、免疫細胞化學第一抗體以1μg/ml室溫下孵育1小時為最佳。 3、芯片捕獲細胞用免疫細胞化學法將胞漿、胞膜抗原染色出來。 4、用免疫細胞化學法驗證細胞芯片捕獲細胞具有高度特異性。 5、用白血病免疫分型細胞芯片