外源性IGFBP-2對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲的影響研究.pdf

1、前言：
　　膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性腦腫瘤，其中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是成人膠質(zhì)瘤中惡性程度最高的一種，患者平均生存時間為15個月[1]。除手術(shù)之外，術(shù)后的放療加化療是有效的治療方法，能明顯延長一些患者的生存時間[2]。然而，各種類型的調(diào)節(jié)因子，如生長因子、激素類因子等導(dǎo)致治療的失敗[3-4]。
　　胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-2(Insulin-like growth factor binding protein-2，IGFBP-2)是

2、由各種組織通過復(fù)雜的調(diào)節(jié)過程產(chǎn)生的[5]，先前研究已經(jīng)證實膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中IGFBP-2的表達(dá)水平明顯高于低級別的神經(jīng)膠質(zhì)瘤和正常腦組織，并通過IGF依賴性或非依賴性作用機(jī)制發(fā)揮其生物學(xué)特性[6-8]。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者血清中IGFBP-2的水平明顯增高，并與患者的生存率呈負(fù)相關(guān)[9-10]。然而，血清中IGFBP-2對本病的進(jìn)展及預(yù)后影響的分子機(jī)制并不清楚。盡管IGFBP-2內(nèi)源性過表達(dá)與細(xì)胞的增殖和侵襲有關(guān)，但這些結(jié)果一直是有爭議的[1

3、1-15]。并不能解釋血清中IGFBP-2的潛在作用，外源性IGFBP-2的作用需要進(jìn)一步被闡明。
　　IGFBP-2含有Arg-Gly-Asp(RGD)細(xì)胞粘附區(qū)域，并能潛在綁定在整合蛋白受體上，并進(jìn)一步激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERKs)?，F(xiàn)已經(jīng)證實當(dāng)惡性腫瘤細(xì)胞受到外部刺激時整合蛋白-ERK通路激活并誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和侵襲[16-18]。本研究旨在探討外源性IGFBP-2對不同級別膠質(zhì)瘤增殖和侵襲的影響，及相關(guān)的分子機(jī)制。同時探討

4、外源性IGFBP-2對膠質(zhì)瘤化療藥物替莫唑胺(Temozolomide，TMZ)耐藥性的影響。
　　材料和方法：
　　1、細(xì)胞培養(yǎng):
　　人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87，U251和U373細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。人惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系T98G從美國標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)收集所獲得(ATCC，Rockville，MD，USA)。SU3膠質(zhì)瘤細(xì)胞由蘇州大學(xué)第二附屬醫(yī)院提供。細(xì)胞培養(yǎng)用含10％胎牛血清(fetal bovine ser

5、um，F(xiàn)BS;Invitrogen)的DMEM(Dulbecco's modifiedEagle's medium;Gibco)培養(yǎng)基。在37℃，5％CO2環(huán)境下培養(yǎng)。
　　2、IGFBP-2過表達(dá)結(jié)構(gòu)構(gòu)建
　　人IGFBP-2 cDNA克隆于pEGFP-N1質(zhì)粒(Clontech，Mountain View，CA，USA)，合成pEGFP-N1-IGFBP-2質(zhì)粒和對照pEGFP-N1質(zhì)粒應(yīng)用陽離子脂質(zhì)體(Lipofect

6、amine，Invitrogen)轉(zhuǎn)染至U87細(xì)胞，通過G418篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，通過western-blot檢測IGFBP-2過表達(dá)的有效性。
　　3、RT-PCR
　　按TrizolTM試劑使用說明提取細(xì)胞總RNA，檢測其濃度，純度和完整性。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明操作，選用Oligo-dT做引物合成第一鏈cDNA，引物序列IGFBP-2 forward,5'-AGGTTGCAGACAATGGCGAT-3', IGFB

7、P-2 reverse,5'-GTAGAAGAGATGACACTCGG-3'; GAPDH forward,5'-GCACCGTCAA-GGCTGAGAAC-3',GAPDH reverse,5'-TGGTG AAGACGCCAGTGGA-3'。反應(yīng)條件為:94℃2分鐘;30×(94℃30秒，61℃30秒，72℃90秒);72℃10分鐘。
　　4、Western Blot法檢測蛋白
　　收集細(xì)胞加入裂解液充分裂解，低溫高速離

8、心（4℃，12000轉(zhuǎn)/min，30min），提取上清為總蛋白。上樣蛋白量為60ug。電泳（12％SDS-PAGE凝膠）、轉(zhuǎn)印(70V，120min)、5％正常小牛血清封閉，一抗4℃孵育過夜，分別與對應(yīng)的二抗室溫孵育2h，ECL顯色，結(jié)果經(jīng)自動電泳凝膠成像分析儀（Chemi Imager5500，AlphaInnotech，USA）采集，進(jìn)行灰度值測定。
　　5、免疫熒光染色
　　接種細(xì)胞于24孔板中，多聚甲醛固定，用0.2

9、％的Triton-X100于常溫打孔15-30分鐘。1％的BSA常溫封閉30分鐘。封閉完后加入一抗，4℃過夜。次日，加入相應(yīng)二抗，室溫孵育1個小時后，Hoechst33342染核，熒光顯微鏡觀察。
　　6、MTT法檢測細(xì)胞增殖
　　將單個細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200ul含103個細(xì)胞，培養(yǎng)24h，每孔加入MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4hr，吸去上清液，加入150ulDMSO(Sigma，USA)，振蕩10min，490

10、nm波長下測定各孔光吸收值，以不含細(xì)胞的等體積培養(yǎng)基作為對照。繪制細(xì)胞生長曲線。
　　7、細(xì)胞計數(shù)
　　細(xì)胞種植在24孔板，每孔種植5×103個細(xì)胞，在DMEM+10％FBS培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h，血清饑餓過夜，不同處理因素處理48h，PBS沖洗，胰酶消化成單細(xì)胞懸液，臺盼藍(lán)染色后進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。
　　8、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期
　　收集對數(shù)生長期細(xì)胞制成1×106個/ml細(xì)胞懸液。75％冷乙醇于4℃固定過夜、離心后制

11、成500μL的細(xì)胞懸液，加碘化丙啶染液于4℃避光孵育45分鐘后上機(jī)檢測，ModFitLT3.0軟件分析細(xì)胞周期。
　　9、Transwell基質(zhì)膠細(xì)胞侵襲試驗
　　用無血清的培養(yǎng)基將Matrigel加入到孔徑為8.0μm的Tranwell小室中，向小室的上室中加入100μl的細(xì)胞懸液(5×105cells/ml)，下室中加入含10％FBS的血清作為趨化誘導(dǎo)劑，孵箱中孵育36小時后取出，用無菌的棉簽擦拭去上室的膠，濾膜經(jīng)固定、

12、染色后封片，鏡檢10個高倍視野(400×)。
　　結(jié)果：
　　1、內(nèi)源性IGFBP-2影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲
　　分別應(yīng)用RT-PCR和western-blot檢測了4種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞和原發(fā)SU3膠質(zhì)瘤細(xì)胞中IGFBP-2的表達(dá)水平。根據(jù)表達(dá)水平在U87細(xì)胞中轉(zhuǎn)染p-EGFP-N1-IGFBP-2質(zhì)粒，并進(jìn)行western-blot檢測，其IGFBP-2的表達(dá)水平明顯上調(diào)。MTT檢測發(fā)現(xiàn)U87細(xì)胞中過表達(dá)IGFBP

13、-2，細(xì)胞的增殖能力并沒有改變，侵襲實驗發(fā)現(xiàn)高表達(dá)IGFBP-2的U87細(xì)胞其侵襲能力明顯增強(qiáng)(P＜0.01)。
　　2、外源性IGFBP-2促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖和侵襲
　　通過相差顯微鏡觀察到IGFBP-2處理后的細(xì)胞其生長速度明顯加快。MTT分析得出外源性IGFBP-2誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，并呈劑量依賴性。125ng/ml和250ng/ml的IGFBP-2處理細(xì)胞后，細(xì)胞的增殖率增加了33.8％-62.7％，500ng/m

14、l的IGFBP-2處理細(xì)胞，其增殖率增加了約1.4倍。在IGFBP-2處理細(xì)胞24h后應(yīng)用PI染色檢測了細(xì)胞周期，結(jié)果顯示IGFBP-2能促進(jìn)U87、U251、SU3細(xì)胞進(jìn)入S期和G2/M期，并呈劑量依賴性。125和250ng/ml的IGFBP-2能使G2/M期細(xì)胞比例由0-2.7％增加到8.1-17.4％，500ng/ml的IGFBP-2使G2/M期細(xì)胞比例達(dá)到30％。
　　應(yīng)用基質(zhì)膠侵襲分析檢測外源性IGFBP-2對U87、U

15、251和SU3細(xì)胞遷移的影響，IGFBP-2使膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力明顯增強(qiáng)，并呈劑量依賴性。125和250ng/ml的IGFBP-2使細(xì)胞的侵襲能力增加了37.8-87.4％，500ng/ml的IGFBP-2使細(xì)胞的侵襲能力增加了近1倍。
　　3、外源性IGFBP-2通過ERK信-號通路促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖和侵襲
　　膠質(zhì)瘤細(xì)胞在500ng/mlIGFBP-2處理培養(yǎng)后，不同時間點(diǎn)提取蛋白應(yīng)用western-blot檢

16、測ERK的活性。盡管總ERK蛋白的表達(dá)水平?jīng)]有增加，但是IGFBP-2處理30min后，與對照組相比，磷酸化的ERK(p-ERK)蛋白表達(dá)水平明顯增高。免疫熒光檢測500ng/ml外源性IGFBP-2處理細(xì)胞30min后增強(qiáng)了ERK的磷酸化和核的轉(zhuǎn)入。在U87、SU3、U251細(xì)胞中加入ERK的阻斷劑PD9805后再加入外源性IGFBP-2培養(yǎng)細(xì)胞，檢測發(fā)現(xiàn)加入ERK阻斷劑后抑制了IGFBP-2誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和侵襲。
　　4、IG

17、FBP-2誘導(dǎo)對TMZ的耐藥性
　　應(yīng)用100μM的TMZ處理U87細(xì)胞后，細(xì)胞的增殖明顯受到抑制(抑制率64.2％)，而在TMZ之前應(yīng)用500ng/ml的IGFBP-2處理細(xì)胞，TMZ對細(xì)胞增殖的抑制被IGFBP-2消除，應(yīng)用ERK的抑制劑PD98059或抗整聯(lián)蛋白β1中和抗體能對抗IGFBP-2的影響。應(yīng)用基質(zhì)膠侵襲實驗檢測了TMZ對U87細(xì)胞侵襲的影響，TMZ處理細(xì)胞后明顯抑制了細(xì)胞的侵襲能力（抑制率44.7％）。而在TMZ