Gab2對膠質(zhì)瘤侵襲的影響與機制研究.pdf

1、膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，發(fā)病在所有顱內(nèi)腫瘤約占40％，侵襲性高和預(yù)后差是膠質(zhì)瘤的典型特征。高侵襲性會導(dǎo)致高復(fù)發(fā)率和高死亡率，因此迫切需要深入理解膠質(zhì)瘤侵襲的分子機制，從而針對性地研究防治膠質(zhì)瘤侵襲的藥物和方法，改善患者的預(yù)后。
　　 Gab2是支架蛋白DOS/Gab家族的一個成員，這個家族還包含哺乳動物的Gab1～Gab4蛋白。Gab2包含N端的PH結(jié)構(gòu)域，中間富含脯氨酸的PRD基元及含多個磷酸化酪氨酸殘基的C端。

2、Gab蛋白絕大多數(shù)是間接通過Grb2介導(dǎo)聚集于活化的受體。在各種刺激下，Gab2發(fā)生酪氨酸磷酸化產(chǎn)生數(shù)個錨定位點來介導(dǎo)與含有SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白如PI3K的p85亞基結(jié)合。Gab2與PI3K的p85亞基的結(jié)合在PI3K-Akt-mTOR信號通路中起重要作用。
　　 近來，一系列的研究顯示Gab2與腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲有關(guān)。首先，Gab2被檢測到在乳腺癌細(xì)胞系與原發(fā)腫瘤中高表達。在Her2/Neu介導(dǎo)的沉默Gab2的小鼠模型中Gab

3、2缺乏的細(xì)胞遷移能力降低，小鼠乳腺癌發(fā)生的肺轉(zhuǎn)移也減少，提示Gab2能促進乳腺癌的轉(zhuǎn)移。其次，有研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌組織中Gab2高表達，而且Gab2通過活化PI3K通路促進卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。另外Gab2也高表達于惡性黑色素瘤、胃癌、肺癌及急性髓性白血病。然而，到目前為止，Gab2蛋白在膠質(zhì)瘤中的表達及Gab2是否影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲尚不明確。
　　 本研究首次檢測了Gab2在膠質(zhì)瘤中的表達，探討了Gab2在膠質(zhì)瘤侵襲中的作用，

4、結(jié)果提示Gab2在膠質(zhì)瘤侵襲中有重要作用，可以作為判斷膠質(zhì)瘤預(yù)后的有效分子指標(biāo)。
　　 方法:
　　 1.組織標(biāo)本:163例福爾馬林固定石蠟包埋的膠質(zhì)瘤組織來源于1997年1月到2007年12月之間在濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院與濰坊市人民醫(yī)院接受腦膠質(zhì)瘤手術(shù)切除的患者，其中膠質(zhì)瘤Ⅰ級(pilocytic astrocytoma)23例(14.1％)，Ⅱ級48例(29.5％)，Ⅲ級52例(31.9％)，Ⅳ級40(24.5％)。所有

5、標(biāo)本經(jīng)10％中性福爾馬林液固定，常規(guī)脫水包埋，5um連續(xù)石蠟切片及HE染色，每例病理切片均經(jīng)兩位病理醫(yī)師確診。按國際抗癌聯(lián)盟(UICC)制定的膠質(zhì)瘤分期標(biāo)準(zhǔn)對患者的詳細(xì)臨床資料進行分析。
　　 2.免疫組織化學(xué):按照Santa Cruz公司所提供的操作步驟進行。切取5um厚的組織切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，檸檬酸緩沖液和微波加熱進行抗原修復(fù)，過氧化氫孵育中和組織中的過氧化氫酶，滴加羊血清封閉，加一抗37℃孵育30min后置于

6、4℃冰箱過夜。第二天加親合素結(jié)合的二抗，ABC溶液孵育，DAB染色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水、透明、干燥后封閉液封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。
　　 3.IHS評分法評分結(jié)果:判斷由兩名經(jīng)驗豐富的病理學(xué)教授，對免疫組化切片結(jié)果判斷評估。細(xì)胞質(zhì)或者核內(nèi)見淡黃色細(xì)顆粒顯著高于背景顏色為陽性細(xì)胞。每張切片選取5個高倍視野觀察結(jié)果。采用IHS評分法，分?jǐn)?shù)可能范圍0～12。IHS分值9～12為強陽性，5～8為中度陽性，1～4為弱陽性，0為陰性。0

7、～4為低表達，5～12為高表達。
　　 4.免疫印跡實驗:組織/細(xì)胞蛋白提取:剪取適量組織并盡量剪碎，加入RIPA裂解液（含(l)mMDTT和蛋白酶抑制劑），4℃攪動裂解20min。細(xì)胞蛋白的提取則向生長鋪滿瓶底的培養(yǎng)瓶中加入1mL預(yù)冷的RIPA裂解液，冰上晃動20min。取得的蛋白裂解液13000 RPM離心10min，測定上清蛋白濃度。加適量體積的上樣緩沖液，煮沸變性。免疫印跡檢測:蛋白溶液經(jīng)SDS電泳、轉(zhuǎn)膜，用含5％脫脂奶

8、粉的TBST封閉液封閉2h，β-actin作為內(nèi)參照，加一抗后4℃過夜。TBST洗膜5min×3次后，加二抗并置于水平搖床搖動2h。按上述方法洗膜后加ECL并曝光。以目的蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參照蛋白條帶的灰度值的比值表示蛋白的相對表達量。實驗重復(fù)3次。
　　 5.細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染:三種膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87、LN229和U251均在含10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞達到60％-70％融合后按照L

9、ipofectamine2000的產(chǎn)品使用說明書進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染操作。將對照小RNA干擾質(zhì)粒與 Gab2特異性小 RNA干擾質(zhì)粒(干擾序列#1:5'-GTGAGAACGATGAGAAATA-3';#2:5'-GATGCAGGCCTGACCTTTA-3')（購自Invitrogen公司）轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，通過RT-PCR、Western-blot驗證干擾效率;使用含有終濃度為0.7ug/mL G418（新霉素）的培養(yǎng)基進行篩選。選擇干擾效率高的穩(wěn)定

10、轉(zhuǎn)染的單克隆細(xì)胞用于后續(xù)試驗。
　　 6.RT-PCR用TransZol Up提細(xì)胞的總RNA，用AMV第一鏈cDNA合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄步驟按試劑說明書進行。以此cDNA鏈為模板在梯度PCR儀上擴增出目的產(chǎn)物。取5uL擴增產(chǎn)物在2％的瓊脂糖凝膠上電泳，凝膠圖像分析系統(tǒng)上拍照，并分析各條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，每組重復(fù)做3次。
　　 7.傷口愈合實驗:將生長狀態(tài)良好的各組細(xì)胞，用10uL槍頭于培

11、養(yǎng)孔中部劃一條寬度相等的橫行細(xì)胞刮除帶，分別于12、18、24 h后分別觀察各組細(xì)胞遷移情況，經(jīng)過不同的時間間隔，記錄三個固定位置處劃痕寬度的變化，即為細(xì)胞遷移距離。拍照。每組設(shè)三個復(fù)孔。
　　 8.細(xì)胞趨化運動實驗:各組細(xì)胞分別重懸于無血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，將細(xì)胞懸液加入上層板中，細(xì)胞終濃度為5×105cell/mL。在趨化小室下層板中加入IGF-1(10ng/mL)。在上下層板之間加入一張孔徑為8um的預(yù)先用fib

12、ronectin包被過的濾膜。細(xì)胞培養(yǎng)3h后，用棉簽將濾膜上層細(xì)胞完全刮去，用HE染色濾膜下層細(xì)胞，顯微鏡下隨機計數(shù)5個高倍視野的細(xì)胞數(shù)，計算平均每高倍視野的穿膜細(xì)胞數(shù)，計算趨化指數(shù)。
　　 9.F-actin聚合實驗:饑餓細(xì)胞3h后以IGF-1(10ng/mL)分別刺激細(xì)胞0S、15S、30S、1min、2min、5min，4％PFA固定10min。F-actin buffer洗后加入帶有熒光的phalloidin(1∶20)

13、室溫下避光孵育60min。F-actin buffer洗后每孔加入100％甲醇900uL萃取phalloidin，離心，取上清液于酶標(biāo)儀讀取數(shù)值。熒光信號進行標(biāo)準(zhǔn)化，計算F-actin的相對含量。
　　 10.Transwell小室基質(zhì)膠侵襲實驗:在上、下層板之間加入一張孔徑8um的預(yù)先用人工基質(zhì)膠覆蓋過的濾膜。將各組細(xì)胞加入Boyden小室上室。下室加入含IGF-1(10ng/mL)的細(xì)胞培養(yǎng)基。24h后擦去上室面的人工基底膠

14、和細(xì)胞，甲醇固定后HE染色，觀察拍照。顯微鏡下隨機計數(shù)5個高倍視野的細(xì)胞數(shù)，計算平均每高倍視野的穿膜細(xì)胞數(shù)，t檢驗比較組間差異。
　　 11.酶聯(lián)免疫吸附試驗收集各組細(xì)胞的培養(yǎng)基并過濾后測定游離的MMP-2與MMP-9的含量。用酶聯(lián)免疫吸附實驗試劑盒測定培養(yǎng)基中MMP-2和MMP-9的表達水平，具體操作參照產(chǎn)品說明書。以全自動酶標(biāo)儀測定每孔的光密度，每個樣品均重復(fù)測定3次，平均值作為最終結(jié)果。
　　 12.裸鼠顱內(nèi)種植瘤

15、試驗:與HE染色Scr/U87及siGab2/U87細(xì)胞用不含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基稀釋至1×108/mL，鼠腦立體定位儀頭架固定裸鼠頭部后，以裸鼠頭部頂枕區(qū)作為穿刺點注入5μl（5×105個瘤細(xì)胞）懸液，觀察各組裸鼠生存期，并對種植瘤組織HE染色觀察種植瘤的生長與侵襲情況。
　　 13.統(tǒng)計學(xué)分析:應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析，定量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差形式表;臨床病理特征與Gab2表達的關(guān)系采用卡方檢驗;生

16、存分析采用log-rank檢驗。兩組間均數(shù)比較用獨立樣本t檢驗;三組及以上的定量資料采用One-WayANOVA，滿足方差齊性假設(shè)時，多重比較用LSD檢驗，不滿足時采用Welch校正，多重比較用Dunnett T3檢驗;涉及兩因素時，使用兩因素析因分析主效應(yīng)和交互效應(yīng)。以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。
　　 結(jié)果:
　　 1.Gab2在腦膠質(zhì)瘤中的表達:升高膠質(zhì)瘤組織與癌周正常組織中Gab2相對表達量的平均值分別為0.83±0

17、.062和0.37±0.067，膠質(zhì)瘤組織中Gab2表達顯著增高，t=20.432，P=0.000。同時膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87、LN229和U251中Gab2均高表達。Gab2高表達率在低級別膠質(zhì)瘤與高級別膠質(zhì)瘤中分別為36.8％和62.1％，有顯著性差異，P=0.001。Gab2蛋白在不同病理級別的神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達隨著WHO的臨床病理級別的增高亦有增高的趨勢。
　　 2.Gab2的表達與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的關(guān)系:根據(jù)免疫組化的Gab

18、2表達結(jié)果，方差分析顯示Gab2表達水平與患者的WHO分級和生存時間顯著相關(guān)，分別為x2=10.189，P=0.001與x2=8.710，P=0.003，而與性別、年齡無顯著性相關(guān)。Log-rank生存分析發(fā)現(xiàn)Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級膠質(zhì)瘤患者中Gab2的高表達水平與各級膠質(zhì)瘤的低生存期顯著相關(guān)，均為P＜0.05。
　　 3.膠質(zhì)瘤組織中Gab2的表達與pAkt的表達相關(guān):腦膠質(zhì)瘤組織免疫組化染色結(jié)果顯示Gab2高表達的膠質(zhì)瘤組織中pAkt

19、的高表達率為75％，而Gab2低表達的膠質(zhì)瘤組織中pAkt的低表達率為63.3％，通過方差分析表明，Gab2的表達與pAkt的表達呈正相關(guān)x2=24.280，P=0.000;低級別膠質(zhì)瘤(Ⅰ+Ⅱ)與高級別膠質(zhì)瘤(Ⅲ+Ⅳ)之間pAkt的表達有顯著性差異，x2=10.189，P=0.001。
　　 4.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人膠質(zhì)瘤U87，LN229和U251細(xì)胞的鑒定:RT-PCR與免疫印跡結(jié)果顯示siGab2/U87、siGab2/LN22

20、9及siGab2/U251細(xì)胞的Gab2mRNA及蛋白的表達分別比U87細(xì)胞以及對照細(xì)胞Scr/U87、Scr/LN229及Scr/U251均顯著降低，從而證明通過小RNA干擾得到了Gab2的表達被穩(wěn)定抑制的siGab2/U87、siGab2/LN229和siGab2/U251細(xì)胞及Gab2表達與U87細(xì)胞比較無顯著改變的對照組Scr/U87、Scr/LN229及Scr/U251細(xì)胞。
　　 5.降低Gab2的表達抑制了膠質(zhì)瘤細(xì)

21、胞的遷移能力傷口愈合:實驗結(jié)果顯示對照組Scr/U87細(xì)胞與Gab2表達減少的siGab2/U87的遷移距離（um）分別為278.222±29.269和530.556±27.758，有顯著性差異，t=18.766，P＜0.001;同樣，Scr/LN229與siGab2/LN229組細(xì)胞的遷移距離(um)分別為309.556±26.378與560.667±41.286，有顯著性差異，t=15.376，P＜0.001;Scr/U251與si

22、Gab2/U251組細(xì)胞的遷移距離（um）分別為409.889±25.487與593.333±33.982，有顯著性差異，t=12.956，P＜0.001?？梢奊ab2表達降低的細(xì)胞爬出劃痕較少，遷移距離小，而對照組細(xì)胞遷移距離較大，部分區(qū)域接近完全融合。這個結(jié)果說明Gab2表達降低后細(xì)胞的遷移能力也隨之減弱。
　　 6.降低Gab2的表達抑制了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的趨化能力:應(yīng)用趨化小室的趨化運動模型，在不同濃度的IGF-1誘導(dǎo)3h后，

23、根據(jù)不同濃度下各組細(xì)胞的趨化能力確定最適IGF-1趨化因子濃度為10ng/mL。在最適趨化濃度下Scr/U87、Scr/LN229及Scr/U251細(xì)胞具有很強的趨化運動能力，可見較多細(xì)胞爬至濾膜下面;siGab2/U87、siGab2/LN229和siGab2/U251細(xì)胞的趨化運動能力顯著降低，Scr/U87與siGab2/U87、Scr/LN229與siGab2/LN229、Scr/U251與siGab2/U251細(xì)胞之間比較趨化

24、能力有顯著性差異，分別為t=8.147，P=0.001;t=4.448，P=0.011; t=3.517，P=0.025。這個結(jié)果說明Gab2表達降低后細(xì)胞的趨化能力也隨之減弱。
　　 7.減少Gab2的表達降低了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力Transwell小室基質(zhì)膠侵襲實驗:結(jié)果顯示，以10ng/mL的IGF-1作為趨化因子誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞穿透基質(zhì)膠和濾膜，Gab2表達降低的siGab2/U87、siGab2/LN229和siGab2

25、/U251細(xì)胞穿透基質(zhì)膠和濾膜的平均數(shù)目分別為20.750±4.113、27.500±6.455、25.000±7.165，而對照組Scr/U87、Scr/LN229及Scr/U251細(xì)胞穿透基質(zhì)膠和濾膜的平均數(shù)目分別為40.750±6.850、45.500±7.853、43.250±4.992，兩組細(xì)胞分別比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，siGab2/U87、siGab2/LN229和siGab2/U251細(xì)胞穿透基質(zhì)膠和濾膜的數(shù)目顯著減少，分

26、別為t=5.007，P=0.002; t=3.541，P=0.012; t=4.180，P=0.006，說明Gab2表達降低后膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力顯著降低。
　　 8.降低Gab2表達:減少了絲狀肌動蛋白(F-actin)的聚合在Scr/U87細(xì)胞內(nèi)，IGF-1刺激15Sec和60Sec時誘發(fā)了快速肌動蛋白聚合，siGab2/U87細(xì)胞內(nèi)肌動蛋白在各時間點聚合顯著減少，Scr/U87與siGab2/U87兩組之間比較有顯著性差異

27、，F(xiàn)=29.819，P＜0.001，Scr/U87細(xì)胞組F-actin的聚合顯著高于siGab2/U87細(xì)胞組，說明Gab2在細(xì)胞骨架重組過程中起著非常重要的作用。
　　 9.Gab2調(diào)節(jié)cofilin與LIMK1/2的磷酸化:應(yīng)用Western blot方法對Scr/U87和siGab2/U87細(xì)胞IGF-1（10ng/mL）誘導(dǎo)下的cofilin及LIMK1/2磷酸化水平進行測定，發(fā)現(xiàn)IGF-1誘導(dǎo)下siGab2/U87細(xì)胞

28、的總cofilin和LIMK1/2的蛋白水平與Scr/U87細(xì)胞比較在各時間點均未見顯著改變，而磷酸化的p-cofilin與p-LIMK1/2在Scr/U87細(xì)胞隨著IGF-1刺激時間的延長而增多。siGab2/U87細(xì)胞隨著IGF-1刺激時間的延長磷酸化的p-cofilin與p-LIMK1/2表達未見顯著改變。IGF-1(10ng/mL)誘導(dǎo)后Scr/U87與siGab2/U87兩組細(xì)胞之間p-cofilin與p-LIMK1/2表達量

29、均有顯著性差異，分別為F=11.781，P=0.005; F=24.206, P＜0.001。
　　 10.Gab2的表達降低后膠質(zhì)瘤細(xì)胞的MMP-2和MMP-9表達減少:酶聯(lián)免疫吸附試驗測定細(xì)胞培養(yǎng)基中游離MMP-2和MMP-9的含量，結(jié)果表明在IGF-1(10ng/mL)誘導(dǎo)下，Gab2降低的siGab2/U87細(xì)胞培養(yǎng)液中MMP-2和MMP-9的相對含量分別為1.14±0.09和1.05±0.11，Scr/U87細(xì)胞的MM

30、P-2和MMP-9含量分別為3.36±0.38和4.09±0.19，兩組細(xì)胞之間比較有統(tǒng)計學(xué)意義，分別為F=72.853，P＜0.001;F=321.272，P＜0.001，siGab2/U87細(xì)胞培養(yǎng)液中MMP-2和MMP-9的相對含量顯著降低;Westem blot法測定各組細(xì)胞MMP-2和MMP-9的含量，IGF-1(10ng/mL)誘導(dǎo)后Gab2降低的siGab2/U87細(xì)胞中MMP-2和MMP-9的含量分別0.69±0.12和

31、0.27±0.09，Scr/U87細(xì)胞的MMP-2和MMP-9含量分別為1.62±0.25和0.95±0.13，siGab2/U87細(xì)胞中MMP-2和MMP-9的含量均顯著降低，與Scr/U87細(xì)胞比較有統(tǒng)計學(xué)意義，分別為F=5.840，P=0.004; F=7.706, P=0.002。
　　 11.降低Gab2的表達抑制Akt的磷酸化:應(yīng)用Western blot方法分析顯示，Gab2降低的siGab2/U87細(xì)胞中IGF-

32、1誘導(dǎo)的磷酸化pAkt水平與對照組Scr/U87細(xì)胞比較顯著降低，兩組細(xì)胞比較有統(tǒng)計學(xué)意義，F(xiàn)=72.100，P＜0.001。本結(jié)果與膠質(zhì)瘤組織中pAkt免疫組化表達結(jié)果相一致。
　　 12.降低Gab2的表達抑制mTOR的磷酸化:Western blot實驗發(fā)現(xiàn)Gab2降低的siGab2/U87細(xì)胞中IGF-1誘導(dǎo)的磷酸化的pmTOR水平與Scr/U87細(xì)胞比較顯著降低，兩組細(xì)胞比較有統(tǒng)計學(xué)意義，F(xiàn)=139.792，P＜0.0

33、01，與siGab2/U87細(xì)胞中pAkt表達結(jié)果相符合，提示Gab2的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與Akt和mTOR的磷酸化密切相關(guān)。
　　 13.荷瘤裸鼠的生存時間:Scr/U87和siGab2/U87組裸鼠的中位生存時間分別為22.5天和26.5天，log-rank檢驗顯示Gab2表達降低的siGab2/U87細(xì)胞組與對照Scr/U87細(xì)胞組比較生存時間顯著延長，兩組生存期的差別有統(tǒng)計學(xué)意義，x2=11.47，P=0.001。
　　

34、14.體內(nèi)原位成瘤的侵襲性:HE染色后Scr/U87組裸鼠種植瘤周圍腦組織有較多腫瘤細(xì)胞浸潤及衛(wèi)星轉(zhuǎn)移灶形成，平均為27.00±4.04個;siGab2/U87組腦組腫瘤病理切片顯示裸鼠腦內(nèi)腫瘤周圍浸潤的腫瘤細(xì)胞及衛(wèi)星轉(zhuǎn)移灶形成較少，巢狀排列不明顯，平均為12.13±2.75個。兩組間比較差別有統(tǒng)計學(xué)意義，t=8.617,P＜0.001。
　　 結(jié)論:
　　 1.Gab2在膠質(zhì)瘤組織中高表達，且其表達水平與膠質(zhì)瘤的WHO

35、臨床病理分級及預(yù)后顯著相關(guān)。
　　 2.pAkt的表達水平與膠質(zhì)瘤的WHO臨床病理分級及Gab2的表達水平顯著相關(guān)。
　　 3.降低Gab2的表達后膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移能力、趨化能力與侵襲能力均顯著下降，說明Gab2與膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。
　　 4.Gab2通過調(diào)節(jié)絲狀肌動蛋白(F-actin)的聚合在細(xì)胞骨架重組過程中起著非常重要的作用。
　　 5.Gab2通過調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)cofilin與LIMK1/2的磷

36、酸化而影響細(xì)胞肌動蛋白的聚合作用，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移與趨化能力。
　　 6.降低Gab2表達減少了膠質(zhì)瘤細(xì)胞MMP-2、MMP-9的生成，從而減弱了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力。
　　 7.Gab2可以通過磷酸化Akt與mTOR，即通過調(diào)節(jié)PI3K-Akt-mTOR信號通路影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲遷移能力。
　　 8.降低Gab2在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達可以減少裸鼠種植膠質(zhì)瘤向周圍腦組織的侵襲，減慢膠質(zhì)瘤的惡性進展，延長生存期。