NUMBL與SIAH1相互作用以及NUMBL抑制NF-κB信號(hào)通路分子機(jī)制的研究.pdf

1、本論文的工作是關(guān)于NOTCH信號(hào)途徑相關(guān)蛋白NUMBL,我們通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)篩選到兩個(gè)蛋白可以與NUMBL發(fā)生相互作用的蛋白:SIAHl和TAB2。
　　圍繞這兩對(duì)蛋白質(zhì)互作對(duì),我們開(kāi)展了兩部分工作:
　　第一部分是NUMBL與SIAH1相互作用的研究;
　　第二部分是NUMBL抑制NF-kB信號(hào)通路的分子機(jī)制的研究。
　　在第一部分中,我們以NuMBL、SIAH1蛋白質(zhì)相互作用對(duì)為研究對(duì)象,探討了NUMB、N

2、UMBL以及SIAHI三者的關(guān)系。首先,GST pull-down和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)NUMBL能夠與SIAH1發(fā)生直接相互作用,并且NUMBL與SIAH1的底物結(jié)合區(qū)結(jié)合,共定位實(shí)驗(yàn)顯示兩者能夠共定位于細(xì)胞質(zhì)中。共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)證實(shí)NUMBL蛋白質(zhì)水平不受SIAH1的影響,不能被SIAHl經(jīng)泛素-蛋白酶體途徑降解。NUMB是NUMBL同源蛋白,也是SIAH1泛素化降解的底物之一。我們發(fā)現(xiàn)NUMBL可以抑制SIAH1對(duì)NUMB的降解,穩(wěn)定了N

3、UMB的蛋白質(zhì)水平,并且體內(nèi)泛素化實(shí)驗(yàn)證實(shí)NUMBL削弱了SIAH1泛素化NUMB。
　　在第二部分中,首先通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活實(shí)驗(yàn)證實(shí)NUMBL能抑制IL-1β及TNF-a誘導(dǎo)的NF-kB信號(hào)的激活,也能抑制TAB2及TRAF6引發(fā)的NF-kB信號(hào)的激活,并且穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GFP-NUMBL的HEK293株對(duì)TNF-a的刺激不敏感。過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明NUMBL可以促進(jìn)TRAF5、TRAF6蛋白質(zhì)水平下降,但不影響TRAF5、TRAF6的mRNA水

4、平轉(zhuǎn)錄。NUMBL可以與TRAF5、TRAF6在HEK293細(xì)胞中免疫共沉淀,但不能與TRAF2蛋白免疫共沉淀。GST pull-down實(shí)驗(yàn)證明NUMBL在可以與TRAF5、TRAF6、RIP在體外直接互作,共定位實(shí)驗(yàn)也證實(shí)NUMBL與TRAF5、TRAF6、RIP能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中共定位于細(xì)胞質(zhì)。
　　我們著重研究了NUMBL與TRAF6這對(duì)互作對(duì),發(fā)現(xiàn)TRAF6的鋅指結(jié)構(gòu)域和TRAF結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)與NUMBL結(jié)合,而NUMBL的

5、C端結(jié)構(gòu)域能與TRAF6相互作用,PTB結(jié)構(gòu)域?qū)τ谂cTRAF6的結(jié)合不是必需的。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)NUMBL會(huì)促進(jìn)TRAF6降解,因此我們著重探討了NUMBL對(duì)TRAF6泛素化的影響:在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,NUMBL對(duì)TRAF6總的泛素化水平以及以K63方式連接的多聚泛素化沒(méi)有明顯影響,但能增強(qiáng)TRAF6以K48方式連接的多聚泛素化。我們進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TRAF6的鋅指基序(111-349aa)可能是發(fā)生以K48方式連接多聚泛素化的區(qū)域。

6、　　總結(jié)我們的工作可以歸納為兩點(diǎn):NUMBL不是SIAH1的泛素化降解底物,但可以抑制SIAHl泛素化降解NUMB;NUMBL通過(guò)與TAB2、TRAF6的互作,促進(jìn)TRAF6蛋白降解,負(fù)調(diào)節(jié)NF-kB信號(hào)通路。NUMBL作為NUMB的同源蛋白,在神經(jīng)皮層發(fā)育分化過(guò)程互補(bǔ)NUMB的功能,除此之外對(duì)于NUMBL功能的知之甚少。我們?cè)噲D從與NUMBL相互作用蛋白的角度出發(fā),在NUMB泛素化降解過(guò)程和負(fù)調(diào)節(jié)NF-kB信號(hào)通路方面,提出了NUMB