Pfu高保真酶結(jié)合雙硫代修飾引物檢測高度近視患者ZNF644基因突變.pdf

1、目的：利用Pfu高保真DNA聚合酶結(jié)合雙硫代磷酸化修飾引物，建立能準(zhǔn)確和敏感識別高度近視患者ZNF644基因I587V、3'UTR+592G>A2個突變位點的方法，為我們檢測和篩查高度近視患者ZNF644基因突變，進(jìn)一步驗證ZNF644基因與高度近視的相關(guān)性提供方法學(xué)依據(jù)。
　　方法：在NCBI Gene數(shù)據(jù)庫中查找到ZNF644基因序列，同時根據(jù)文獻(xiàn)中所報道的關(guān)于ZNF644基因的突變情況，明確其I587V和3'UTR+592G

2、>A兩個突變位點所在序列中的位置。提取正常人血液基因組 DNA，根據(jù)已知 ZNF644基因突變I587V、3'UTR+592G>A區(qū)域序列，分別設(shè)計目的基因序列擴(kuò)增引物進(jìn)行引物延伸反應(yīng)，將其PCR產(chǎn)物克隆到pGEM-T EASY載體，得到ZNF644基因的野生型克隆，再用定點突變方法突變?yōu)橥蛔兾稽c的基因突變型克隆，然后以此構(gòu)建的重組質(zhì)粒作為研究模板，分別設(shè)計3’末端與突變型基因位點或野生型基因位點配對的引物，雙硫代磷酸化修飾3’末端并偶

3、聯(lián)高保真聚合酶構(gòu)成的基因突變敏感性分子開關(guān)，對突變型質(zhì)粒模板及野生型質(zhì)粒模板進(jìn)行引物延伸反應(yīng)并通過凝膠成像系統(tǒng)對其進(jìn)行分析。
　　結(jié)果：明確了I587V、3'UTR+592G>A2個突變所在的基因序列以及其突變位點所在的位置，克隆出了含目的突變位點的DNA片段，并且定點突變得到了相應(yīng)突變位點的突變基因型，構(gòu)建出了含有目的基因的野生型質(zhì)粒模板和突變型質(zhì)粒模板。當(dāng)突變引物對與突變型質(zhì)粒模板配對時，引物被延伸，有 PCR產(chǎn)物；與野生型質(zhì)