靈長(zhǎng)類(lèi)特異表達(dá)基因TCP10L的功能研究.pdf

1、本論文共分兩個(gè)部分，其中第一個(gè)部分闡述的是對(duì)一個(gè)靈長(zhǎng)類(lèi)特異表達(dá)基因TCPIOL進(jìn)行功能研究的工作，第二部分闡述的是克隆和鑒定一個(gè)新的人類(lèi)含SPRY結(jié)構(gòu)域蛋白基因SPRYD4并對(duì)其功能進(jìn)行初探的工作。 本論文的第一部分中我們首先通過(guò)生物信息學(xué)分析來(lái)研究了TCPIOL的進(jìn)化與起源，分析結(jié)果揭示了TCPJOL是通過(guò)片段復(fù)制機(jī)制而來(lái)的裂變基因(fissiongene)。我們結(jié)合Westen Blot檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)手段鑒定了復(fù)制而來(lái)的裂變基因

2、TCPIOL是靈長(zhǎng)類(lèi)特異表達(dá)的新生基因。 接著我們?nèi)娣治隽薚CP1OL的功能。它能夠通過(guò)其亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)形成同源二聚體并定位在細(xì)胞核中行使功能；當(dāng)SMMC7721中過(guò)量表達(dá)TCP1OL時(shí)細(xì)胞出現(xiàn)S期增多的現(xiàn)象，而當(dāng)通過(guò)RNAi把TCPIOL消減掉后細(xì)胞S期增多的現(xiàn)象消失并且TCP1OL導(dǎo)致細(xì)胞S期增多的現(xiàn)象和其亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)相關(guān)；而當(dāng)SMMC7721中過(guò)量表達(dá)TCP1OL時(shí)細(xì)胞克隆形成率上升，并且這個(gè)上升與TCP1OL的亮氨酸

3、拉鏈結(jié)構(gòu)的完整性正相關(guān)，而當(dāng)把TCP1OL消減掉后細(xì)胞克隆形成率則下降，提示TCPIOL與細(xì)胞的增殖相關(guān)。 酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)顯示TCP1OL可以和Nek6相互作用，隨后TCP1OL和Nek6以及TCP1OL和Nek7的互作關(guān)系得到免疫共沉淀，GST-PullDown以及細(xì)胞共定位等方面的確證；同位素32P摻入實(shí)驗(yàn)的分析顯示TCP1OL能夠被Nek6或者Nek7所磷酸化，提示TCP1OL可能是這兩個(gè)激酶的底物，隨后的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，

4、Nek6和Nek7可能通過(guò)對(duì)TCP1OL的磷酸化作用來(lái)調(diào)節(jié)TCP1OL的穩(wěn)定性，Nek6能夠減弱TCPIOL的穩(wěn)定性而Nek7則增強(qiáng)TCP1OL的穩(wěn)定性；接下來(lái)的研究結(jié)果表明TCP1OL可能不僅僅是這兩個(gè)激酶的底物，也可能是這兩個(gè)激酶的負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子，我們發(fā)現(xiàn)TCP1OL能夠增強(qiáng)Nek6的Thr210Pro基序中Thr210的磷酸化水平而只能稍微增加Nek7的Thr190Pro基序中Thr190的磷酸化水平，從而可能調(diào)控這兩個(gè)激酶的激酶

5、活性。 生物基因組進(jìn)化中的保守性，使得具有某一功能的基因在不同物種之間常具有一定的同源性。這種同源性對(duì)新基因的克隆和功能研究具有重要的指導(dǎo)意義。利用這種基因間的同源性，有目的的克隆基因家族新成員，是新基因克隆的有效策略之一。 本論文的第二部分利用EST同源克隆策略，我們從人腦組織cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增克隆得到了一個(gè)新的人類(lèi)含SPRY結(jié)構(gòu)域基因SPRYD4，并對(duì)該基因的功能進(jìn)行了初步的分析。生物信息學(xué)的分析顯示該基因定位于人類(lèi)

6、染色體12q13.2，包含兩個(gè)外顯子，其cDNA長(zhǎng)為1201bp，該基因的開(kāi)放閱讀框編碼207個(gè)氨基酸。RT—PCR分析顯示，SPRYD4在人類(lèi)18種組織中呈廣譜性表達(dá)。亞細(xì)胞定位的結(jié)果顯示，過(guò)量表達(dá)的SPRYD4蛋白在COS7細(xì)胞中定位在細(xì)胞核。 綜上所述，第一本文的研究結(jié)果首次鑒定了TCPIOL，是通過(guò)基因組的片段復(fù)制機(jī)制復(fù)制而來(lái)的裂變基因，并鑒定TCPIOL靈長(zhǎng)類(lèi)特異表達(dá)的基因；TCPIOL可能通過(guò)與細(xì)胞周期相關(guān)激酶Nek