睪丸新基因的克隆及其在隱睪模型中的表達(dá)分析.pdf

1、第一部分 目的：克隆睪丸發(fā)育及生精相關(guān)基因，為進(jìn)一步研究其功能、精子發(fā)生的分子調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 方法：從二級(jí)表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed sequence tags，EST）數(shù)據(jù)庫(kù)ZooDDD中獲得人類正常睪丸表達(dá)的EST，檢索其同源序列，應(yīng)用Biolign軟件拼接成基序（contigs），GeneScan軟件預(yù)測(cè)對(duì)應(yīng)基因組序列中的外顯子位置，并將其拼接成完整的編碼序列；針對(duì)開(kāi)放閱讀框設(shè)計(jì)引物序列，采用RT-PCR

2、 從人類睪丸組織中克隆新基因的cDNA，分析該基因在人類各臟器組織中的表達(dá)，并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析。 結(jié)果：在人類22 號(hào)染色體的49311047 K—49368620K 間克隆出一新基因THEG-2，編碼序列全長(zhǎng)267 bp，編碼88個(gè)氨基酸，分子量MW10601.09，等電點(diǎn)4.32。RT-PCR 證實(shí)該基因開(kāi)放閱讀框正確，在人類睪丸組織中高表達(dá)，獲得GenBank登錄號(hào)EU079024。預(yù)測(cè)THEG-2蛋白理論等電

3、點(diǎn)為pI 4.32，相對(duì)分子量為MW10601.09，其亞細(xì)胞定位可能位于細(xì)胞核，功能預(yù)測(cè)為生長(zhǎng)因子。 結(jié)論：獲得人類睪丸高表達(dá)基因THEG-2，為進(jìn)一步研究該基因的生物學(xué)功能和表達(dá)調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。 第二部分 目的：利用模式生物小鼠，探討睪丸高表達(dá)基因THEG-2 在睪丸發(fā)育過(guò)程中的作用。 方法：通過(guò)dbEST數(shù)據(jù)庫(kù)檢索出與THEG-2基因高度同源的EST序列，構(gòu)建EST疊加群（contigs），Biol

4、ign軟件拼接，GeneScan軟件預(yù)測(cè)contigs 對(duì)應(yīng)的基因組序列中的外顯子、內(nèi)含子；針對(duì)開(kāi)放閱讀框設(shè)計(jì)引物序列，采用RT-PCR 從小鼠睪丸組織中克隆新基因的cDNA，分析該基因在小鼠睪丸不同發(fā)育階段中的表達(dá)，并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析。 結(jié)果：成功克隆了THEG-2 高度同源的小鼠睪丸新基因TSEG-2，全長(zhǎng)451 bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?67 bp，編碼88個(gè)氨基酸。RT-PCR 證實(shí)該基因開(kāi)放閱讀框正確，TSEG-

5、2 在小鼠睪丸組織中特異性表達(dá)，在4、9、14、18、21、38日齡和2、6月齡小鼠睪丸組織中呈現(xiàn)規(guī)律性表達(dá),且與小鼠其它c(diǎn)DNA 無(wú)同源性，獲得GenBank 登錄號(hào)EU079025。功能區(qū)分析發(fā)現(xiàn)，小鼠TSEG-2 cDNA序列定位于染色體15qE3，為可溶性非分泌型蛋白，有2個(gè)可能的蛋白激酶C(PKC)磷酸化位點(diǎn)，1個(gè)酪蛋白激酶(CK2) Ⅱ磷酸化位點(diǎn)，并可能是一種核蛋白。結(jié)論：獲得小鼠睪丸特異性表達(dá)基因TSEG-2，與睪丸發(fā)育各

6、階段密切相關(guān)。 第三部分 目的：建立雌二醇誘導(dǎo)的小鼠隱睪模型，并對(duì)其進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察，同時(shí)對(duì)新克隆的TSEG-2基因在隱睪模型的表達(dá)特征進(jìn)行研究。 方法：35 只雄性新生BABL/C 仔鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、溶劑對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組（n=15）于生后第3-30天皮下注射17-β雌二醇4 μl(4 μg/d)，溶劑對(duì)照組（n=10）皮下注射等量丙二醇，正常對(duì)照組不給予任何處理。生后第35天，觀察各組睪丸位置、大

7、小，采用HE 染色、透射電鏡進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀測(cè)。采用RT-PCR 方法研究TSEG-2基因在隱睪模型中的表達(dá)特點(diǎn)。 結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組隱睪發(fā)生率100％，均為雙側(cè)隱睪，而對(duì)照組和溶劑對(duì)照組無(wú)隱睪發(fā)生。與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組睪丸大小明顯縮小，生精小管上皮數(shù)目減少，管腔消失，精母細(xì)胞和精原細(xì)胞核皺縮，支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞核仁空泡變性，未見(jiàn)成熟精子。 對(duì)照組和溶劑對(duì)照組TSEG-2基因高表達(dá)，而TSEG-2基因在隱睪模型組中表達(dá)顯著下調(diào)