microRNA-148a與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、原發(fā)性肝癌主要包括肝細(xì)胞癌、膽管細(xì)胞型肝癌和肝血管瘤。作為死亡率第三的癌癥,肝細(xì)胞癌(HCC)占原發(fā)性肝癌的85-90％,是世界范圍內(nèi)第五大常見癌瘤。近來研究表明,microRNA的異常調(diào)節(jié)是人類癌癥發(fā)展中出現(xiàn)的普遍特征。MicroRNA(miRNA)是一類高度保守的非編碼小分子RNA,其生物學(xué)功能為負(fù)性調(diào)控其靶基因表達(dá)。MiR-148/152家族成員 miR-148a的抑癌基因樣作用及其表達(dá)下調(diào)已在多種腫瘤中被相繼發(fā)現(xiàn),但是,其在肝癌

2、中的下調(diào)及作用機(jī)制尚不清楚。
　　本文探討了肝癌中miR-148a的表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié)及其對(duì)肝癌細(xì)胞的影響。實(shí)驗(yàn)采用一步法實(shí)時(shí)定量 PCR檢測(cè)人源肝癌細(xì)胞系 HepG2,SMMC-7721和HCCLM3及正常肝組織細(xì)胞系L02中miR-148a的表達(dá)情況,通過甲基化特異性PCR(MSP)檢測(cè)各細(xì)胞系中 miR-148a啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平,通過熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)、RT-PCR和Western Blot檢測(cè)DNMT1的表達(dá)水平的差

3、異與變化,通過脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染DNMT1 siRNA至HepG2細(xì)胞系中以沉默DNMT1表達(dá),轉(zhuǎn)染miR-148a mimics(模擬物)至HepG2細(xì)胞系中后,利用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法以及流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)觀察 miR-148a過表達(dá)對(duì)HepG2增殖、凋亡與周期的影響。應(yīng)用生物信息方法發(fā)現(xiàn) miR-148a潛在靶向DNMT1。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn),由于其啟動(dòng)子區(qū) CpG島的異常超甲基化,miR-148

4、a在肝癌細(xì)胞系中表現(xiàn)甲基化控制的表達(dá)沉默,且其表達(dá)可被甲基化抑制劑5-aza-dC呈劑量依賴性恢復(fù)。同時(shí),維持甲基化水平的甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1表達(dá)水平在肝癌細(xì)胞系中異常上調(diào),且其過表達(dá)與miR-148a啟動(dòng)子區(qū)高甲基化水平密切相關(guān)。另一方面,DNMT1作為miR-148a靶蛋白,其表達(dá)水平可被miR-148a過表達(dá)抑制,提示在肝癌細(xì)胞系中 DNMT1-miR-148a負(fù)性調(diào)節(jié)回路的存在。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)miR-148a過表達(dá)可以通過對(duì)肝癌細(xì)胞