木素過(guò)氧化物酶和乙二醛氧化酶的共固定化及在手性合成中的應(yīng)用.pdf

1、本文首先對(duì)限氮培養(yǎng)基在富氧環(huán)境下培養(yǎng)黃孢原毛平革菌同時(shí)合成木素過(guò)氧化物酶和乙二醛氧化酶的條件進(jìn)行了研究，在此基礎(chǔ)上研究了雙酶的初步分離純化、共固定化以及在手性合成中的應(yīng)用。 本文采用限氮培養(yǎng)基在富氧環(huán)境下培養(yǎng)黃孢原毛平革菌合成木素過(guò)氧化物酶和乙二醛氧化酶，實(shí)驗(yàn)表明：葡萄糖和酒石酸銨分別為最佳碳、氮源；最佳碳源濃度為15g/L和10g/L時(shí)；最佳氮源濃度為0.2g/L和0.3g/L(分別對(duì)應(yīng)于木素過(guò)氧化物酶和乙二醛氧化酶的合成)

2、；最佳維生素B1、Tween-80和苯甲醇濃度分別為3mg/L、0.05％和5.0mmol/L。最佳裝液量為50ml/250ml三角瓶；兩天后培養(yǎng)基的最佳傾液量為50％，最佳通氧頻率為1次/天，最佳搖床轉(zhuǎn)速為80rpm，最佳接種量為3×107/瓶，最佳溫度為37℃。在最優(yōu)培養(yǎng)條件下，木素過(guò)氧化物酶和乙二醛氧化酶的酶活分別達(dá)到448.3U/L和27.34U/L。 采用先除多糖，再超濾濃縮，最后鹽析的方法對(duì)木素過(guò)氧化物酶和乙二醛氧

3、化酶進(jìn)行了初步的分離純化。結(jié)果表明：1/3體積的冷丙酮和一次凍溶為最佳除多糖方法；超濾濃縮后的酶液在60％飽和硫酸銨濃度下的鹽析效果最佳，木素過(guò)氧化物酶和乙二醛氧化酶均獲得最高的比酶活，分別達(dá)6042.6U/g和513.63U/g。 選取殼聚糖作載體，戊二醛作載體的活化劑對(duì)木素過(guò)氧化物酶和乙二醛氧化酶進(jìn)行共固定化。實(shí)驗(yàn)表明：采用先活化載體后共價(jià)結(jié)合酶的順序比同時(shí)活化和共價(jià)好；戊二醛作活化劑比乙二醛好；最佳粗酶液加量為30ml/

4、0.4g載體；最佳戊二醛濃度為0.2％；戊二醛最佳處理時(shí)間和酶的最佳固定化時(shí)間均為10h。固定化后，木素過(guò)氧化物酶和乙二醛氧化酶的酶活回收率分別達(dá)到了81.4％和45.2％。 應(yīng)用木素過(guò)氧化物酶對(duì)兩個(gè)代表性的手性物質(zhì)——BINOL(軸手性)和苯甲亞砜(點(diǎn)手性)在水互溶有機(jī)溶劑單相體系中的催化合成進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：兩產(chǎn)物均為R型產(chǎn)物；底物2-萘酚和苯甲硫醚的最佳加量分別為1.0mmol和0.4mmol；H2O2的最佳加入方式