腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和侵襲性的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　前列腺癌(prostate cancer, PCa)是影響西方國(guó)家男性的最常見(jiàn)的癌癥，在2016年，僅在美國(guó)就會(huì)有超過(guò)18萬(wàn)個(gè)前列腺癌新發(fā)病例，占所有新發(fā)癌癥的五分之一以上。全世界每年由癌癥引起的近800萬(wàn)死亡病例中的90％以上主要是癌癥的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散造成的，轉(zhuǎn)移是一種復(fù)雜的多步驟過(guò)程，通過(guò)該過(guò)程癌細(xì)胞從原發(fā)性腫瘤擴(kuò)散到周?chē)M織和遠(yuǎn)端器官。在腫瘤進(jìn)展期間，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞募集到腫瘤周?chē)?，從而改變腫瘤微環(huán)境以加速腫瘤的

2、進(jìn)展，從腫瘤和基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的各種微環(huán)境信號(hào)可促使巨噬細(xì)胞改變它們的功能表型。巨噬細(xì)胞可分為兩種:經(jīng)典M1型和M2型巨噬細(xì)胞，M1型巨噬細(xì)胞是參與炎癥反應(yīng)和抗腫瘤免疫的關(guān)鍵，相反，M2型巨噬細(xì)胞則影響抗炎效果并有促腫瘤活性。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages，TAM)表現(xiàn)出與M2型巨噬細(xì)胞相似的功能，并且是腫瘤微環(huán)境的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。在腫瘤晚期，TAM為腫瘤生長(zhǎng)、存活和血管生成提供有利的微環(huán)境，產(chǎn)生多種

3、促炎細(xì)胞因子，如IL-6，其參與腫瘤細(xì)胞周期凋亡和抑制重要基因的誘導(dǎo)。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)是M1型巨噬細(xì)胞的特異性標(biāo)記物，而精氨酸激酶-1(arginase-1，Arg-1)是TAM的特異性標(biāo)記物。
　　在腫瘤微環(huán)境中，巨噬細(xì)胞是最豐富的炎癥細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞及其周?chē)?xì)胞在其微環(huán)境中的相互作用對(duì)于腫瘤的惡性進(jìn)展發(fā)揮至關(guān)重要的作用。因此我們假想，在微環(huán)境中，腫瘤細(xì)

4、胞分泌的相關(guān)因子可使M1型巨噬細(xì)胞向M2型極化(TAMs)，同時(shí)，TAMs可能促進(jìn)了腫瘤的侵襲性與進(jìn)展速度。
　　目的:
　　探討腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞與前列腺癌細(xì)胞在微環(huán)境中相互作用對(duì)前列腺癌侵襲與進(jìn)展的機(jī)制。
　　方法:
　　1.培養(yǎng)人前列腺癌細(xì)胞PC-3、C4-2細(xì)胞，培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞，利用共培養(yǎng)技術(shù)將PC-3細(xì)胞與RAW264.7細(xì)胞共同培養(yǎng)24h，PBS作為對(duì)照組;將C4-2細(xì)胞與RAW2

5、64.7細(xì)胞共同培養(yǎng)24h，PBS作為對(duì)照組。
　　2.利用Western blot技術(shù)觀察PC-3細(xì)胞對(duì)RAW264.7細(xì)胞、C4-2細(xì)胞對(duì)RAW264.7細(xì)胞影響，檢測(cè)M1特異性指標(biāo)iNOS、M2特異性指標(biāo)Arg-1的蛋白水平表達(dá)量。
　　3.利用Western blot技術(shù)觀察PC-3細(xì)胞、C4-2細(xì)胞對(duì)巨噬RAW264.7細(xì)胞中AMPK、p-AMPK、mTor、p-mTor的蛋白水平表達(dá)量。
　　4.利用細(xì)胞免

6、疫熒光染色技術(shù)觀察PC-3細(xì)胞、C4-2細(xì)胞對(duì)RAW264.7細(xì)胞中iNOS、Arg-1的蛋白水平表達(dá)量。
　　5.利用Transwell遷移侵襲實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察RAW264.7細(xì)胞對(duì)PC-3細(xì)胞、C4-2細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移能力。
　　6.利用Western blot技術(shù)觀察RAW264.7細(xì)胞對(duì)PC-3細(xì)胞、C4-2細(xì)胞中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)指標(biāo)(E-cadherin、N-Cadherin、Vimentin)和侵襲能

7、力指標(biāo)Icam-1的蛋白水平表達(dá)量。
　　結(jié)果:
　　1.小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞與人前列腺癌細(xì)胞PC-3、C4-2細(xì)胞共培養(yǎng)24h后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯變化，巨噬細(xì)胞由圓形小細(xì)胞形成多角的大細(xì)胞、長(zhǎng)梭形細(xì)胞。
　　2.Western blot結(jié)果顯示，與PBS對(duì)照組相比，PC-3細(xì)胞和C4-2細(xì)胞對(duì)RAW264.7細(xì)胞作用24h后，iNOS的蛋白表達(dá)量下降，Arg-1的蛋白水平表達(dá)量增加。
　　3.We

8、stern blot結(jié)果顯示，與PBS對(duì)照組相比，PC-3細(xì)胞和C4-2細(xì)胞對(duì)RAW264.7細(xì)胞作用24h后，p-AMPK的蛋白表達(dá)量增加、p-mTor的蛋白水平表達(dá)量減少。
　　4.細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，與PBS對(duì)照組相比，PC-3細(xì)胞和C4-2細(xì)胞對(duì)RAW264.7細(xì)胞作用24h后，iNOS的蛋白表達(dá)量下降，Arg-1的蛋白水平表達(dá)量增加。
　　5.Transwell結(jié)果顯示，與PBS對(duì)照組相比，RAW264.7細(xì)胞對(duì)

9、PC-3細(xì)胞和C4-2細(xì)胞作用24h后，遷移細(xì)胞數(shù)量明顯增加，細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)能力增加;細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與PBS對(duì)照組相比，RAW264.7細(xì)胞對(duì)PC-3細(xì)胞、C4-2細(xì)胞作用24h后，細(xì)胞的遷移速度明顯增加。
　　6.Western blot結(jié)果顯示，與PBS對(duì)照組相比，RAW264.7細(xì)胞對(duì)PC-3細(xì)胞、C4-2細(xì)胞作用24h后，N-Cadherin、Vimentin、Icam-1的蛋白表達(dá)量明顯增加，E-cadherin

10、的蛋白表達(dá)量明顯減少。
　　結(jié)論:
　　1.在腫瘤微環(huán)境中，前列腺癌細(xì)胞可影響巨噬細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，并可通過(guò)促進(jìn)AMPK磷酸化蛋白表達(dá)，抑制mTor蛋白表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞由M1向M2極化。
　　2.在腫瘤微環(huán)境中，極化的M2巨噬細(xì)胞(TAM)可促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程，從而增加前列腺癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移能力，加快進(jìn)展速度。
　　3.TAM與前列腺癌細(xì)胞在其微環(huán)境中的相互作用對(duì)于腫瘤的惡性進(jìn)展發(fā)揮重要的作用。