嗜酸乳桿菌β-半乳糖苷酶基因的克隆及其作為食品級(jí)篩選標(biāo)記的研究.pdf

1、目的:
　　 在乳酸乳球菌克隆表達(dá)嗜酸乳桿菌β-半乳糖苷酶基因(lacZ),并觀察以lacZ基因作為食品級(jí)篩選標(biāo)記的活性及篩選穩(wěn)定性,為構(gòu)建食品級(jí)表達(dá)載體奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.根據(jù)GenBank已報(bào)道的嗜酸乳桿菌ATCC4356-lacZ基因的DNA序列,利用PCR引物設(shè)計(jì)和分析軟件,設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增ATCC4356-lacZ基因,并將其克隆入乳酸菌表達(dá)質(zhì)粒載體pMG36e中構(gòu)建重組質(zhì)粒pMG36e-

2、lacZ,借助X-gal顯色在大腸桿菌DH5α中篩選陽(yáng)性克隆子。
　　 2.優(yōu)化乳酸乳球菌MG1363的電轉(zhuǎn)化條件,并在此條件下將重組質(zhì)粒pMG36e-lacZ電轉(zhuǎn)入MG1363中,借助X-gal顯色篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子MGl363-lacZ以觀察篩選活性。
　　 3.MG1363-lacZ在含乳糖的M17培養(yǎng)基中表達(dá)β-半乳糖苷酶,SDS-PAGE和native-PAGE分析蛋白表達(dá)和酶活性。通過(guò)X-gal顯色篩選方法將重組

3、菌株MG1363-lacZ傳60代,并測(cè)定β-半乳糖苷酶酶活和比活力以觀察X-gal篩選的穩(wěn)定性。
　　 結(jié)果:
　　 1.成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pMG36e-lacZ,經(jīng)PCR和酶切鑒定后與預(yù)期結(jié)果完全吻合。核酸序列測(cè)定顯示插入的lacZ基因序列與預(yù)期結(jié)果亦相符。借助X-gal顯色從大腸桿菌DH5α中成功篩選出陽(yáng)性克隆子。
　　 2.優(yōu)化了MG1363的電轉(zhuǎn)化條件,確定了最佳參數(shù):電壓2kV,時(shí)間5ms。利用電轉(zhuǎn)化

4、成功地將重組質(zhì)粒pMG36e-lacZ導(dǎo)入MG1363中,并借助X-gal顯色成功篩選出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子MG1363-lacZ。
　　 3.SDS-PAGE結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)化子MG1363-lacZ能表達(dá)約70kDa的蛋白,native-PAGE分析顯示,該蛋白具有β-半乳糖苷酶活性。對(duì)借助X-gal傳60代后的重組乳酸乳球菌進(jìn)行β-半乳糖苷酶比活力檢測(cè),與X-gal篩選的第二代相比沒(méi)有顯著差異(P=0.596>0.05),與紅霉素篩選比