隆線溞孤雌溞cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及Chemonsensory基因的研究.pdf

1、枝角類又稱水蚤,是一類在淡水中普遍存在的小型浮游動(dòng)物,隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門,甲殼綱。是魚類和無(wú)脊椎動(dòng)物的開口餌料,在水生態(tài)系統(tǒng)中有重要的作用;同時(shí)由于它們能夠指示環(huán)境中的有毒物質(zhì),并具有易于培養(yǎng)、生活周期短等特點(diǎn),因此被廣泛地應(yīng)用于形態(tài)學(xué),種群生態(tài)學(xué),種質(zhì)遺傳學(xué),環(huán)境評(píng)估及毒理學(xué)等研究領(lǐng)域。水蚤的生殖方式十分特殊,它們具有兩種生殖模式。當(dāng)環(huán)境條件適宜的時(shí)候,以孤雌生殖（卵子不經(jīng)受精而直接發(fā)育成子代的生殖方式）為主,然而當(dāng)受到諸如溫度改變,食

2、物匱乏,種群密度過(guò)大等環(huán)境脅迫因素時(shí),生殖方式即會(huì)轉(zhuǎn)為兩性生殖。因此,由于其性別決定和環(huán)境可誘導(dǎo)性別轉(zhuǎn)化的特殊性,使蚤類成為生殖轉(zhuǎn)化研究的良好模式動(dòng)物。但大多研究集中于環(huán)境因子對(duì)生殖影響方面,從分子生物學(xué)角度探討生殖發(fā)育規(guī)律十分有限。表達(dá)序列標(biāo)簽（包含在cDNA文庫(kù)中的序列）分析技術(shù)是一項(xiàng)在組織細(xì)胞中能夠有效鑒別新基因和測(cè)量基因表達(dá)譜的方法。目前已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于新基因的發(fā)現(xiàn)、基因組物理圖譜的構(gòu)建、基因組中基因的預(yù)測(cè)、轉(zhuǎn)錄模式的確定、單核

3、苷酸多態(tài)性的發(fā)現(xiàn)和分子標(biāo)記的建立等研究中。本文以淡水水域常見種—隆線溞[Daphnia（Ctenodaphnia） carinata]孤雌溞成體為研究對(duì)象,運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建其cDNA文庫(kù),采用生物信息學(xué)手段對(duì)文庫(kù)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并構(gòu)建基因表達(dá)譜。從文庫(kù)中篩選出功能注釋為Chemosensory蛋白的片段,通過(guò)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)獲得其部分序列。運(yùn)用分子生物學(xué)、毒理學(xué)以及透射電鏡等技術(shù)在不同環(huán)境條件刺激下,分析該蛋白表達(dá)差異和對(duì)隆線溞生長(zhǎng)和生

4、殖的影響。旨在探索枝角類生殖轉(zhuǎn)化的規(guī)律和分子基礎(chǔ),拓展和豐富甲殼動(dòng)物發(fā)育生物學(xué)的研究?jī)?nèi)容,促進(jìn)枝角類生殖生物學(xué)研究的深入和發(fā)展,同時(shí)為實(shí)現(xiàn)枝角類生殖轉(zhuǎn)化的人為調(diào)控奠定基礎(chǔ)。本論文主要研究結(jié)果與結(jié)論如下:1.隆線溞孤雌溞cDNA文庫(kù)的構(gòu)建、EST序列分析以及與大型溞基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)研究首次構(gòu)建了隆線溞孤雌溞成體的cDNA文庫(kù),并從中隨機(jī)選取3072個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序,最終得到3040個(gè)ESTs,平均長(zhǎng)度571bp。去除載體和低質(zhì)量序列后得到

5、2997個(gè)高質(zhì)量EST序列（GenBank accession no.:GD269049-GD272045）,平均長(zhǎng)度為617bp。2997個(gè)序列經(jīng)拼接聚類后得到了465條contigs和1030條singletons,因此最終得到的unique sequences為1495條。通過(guò)BLASTX和BLASTN程序分別與非冗余蛋白和核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列同源性比對(duì)。E-value低于1.0×10-5認(rèn)為序列顯著性同源。有959條uniques

6、equences（64％）與已知基因有較高同源性。經(jīng)功能注釋與分類后,發(fā)現(xiàn)了一些與水溞生殖發(fā)育以及環(huán)境感應(yīng)相關(guān)的新基因。該文庫(kù)與報(bào)道的大型溞全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)比較,結(jié)果顯示,1495個(gè)uniquesequences中有1283條（86%）序列與大型溞基因組序列可匹配成功。2.不同環(huán)境因子對(duì)隆線溞生長(zhǎng)和生殖的影響以及Chemonsensory基因的表達(dá)差異通過(guò)環(huán)境因子誘導(dǎo),觀測(cè)分析隆線溞各相關(guān)生理生化指標(biāo)的變化,探討環(huán)境因子對(duì)隆線溞生殖轉(zhuǎn)化的

7、的影響以及環(huán)境感應(yīng)蛋白在其應(yīng)激過(guò)程中表達(dá)量的變化及作用。2.1環(huán)境因子對(duì)隆線溞生長(zhǎng)發(fā)育和生殖的影響通過(guò)單因子梯度試驗(yàn)方法,研究了添加不同濃度CdCl2（0.32,0.56,1.00,1.80,3.20,5.60,10.00,18.00,32.00μg/L）以及改變溫度（高溫32℃,低溫6℃）對(duì)隆線溞體長(zhǎng)、第一次懷卵日、懷卵數(shù)的影響以及CdCl2對(duì)隆線溞腸壁超微結(jié)構(gòu)的損傷。溫度及重金屬離子對(duì)隆線漢溞的生殖發(fā)育都有較大影響:Cd2+對(duì)隆線溞

8、24h,48h,72h,96h的LC50分別為1800,560,282,132.1μg/L。9個(gè)安全濃度處理隆線溞一個(gè)生殖周期后,在Cd2+的干擾下,與對(duì)照組相比,隆線溞在低濃度下體長(zhǎng)有所增加,在較高濃度下,體長(zhǎng)表現(xiàn)出明顯的下降趨勢(shì);Cd2+使其懷卵日提前,皆有早熟趨勢(shì)。懷卵數(shù)在低濃度下變化不大,高濃度下急劇減少,但孵化率受其影響不明顯。隆線溞腸壁細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的損傷程度隨著鎘濃度的升高而明顯加劇。與對(duì)照組相比,高溫對(duì)隆線溞的生長(zhǎng)無(wú)明顯促

9、進(jìn)作用,但會(huì)提早性成熟時(shí)間;低溫不但會(huì)抑制其生長(zhǎng),對(duì)生殖也有抑制作用,且低溫對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育的影響強(qiáng)于高溫。本研究結(jié)果可為漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)和工業(yè)廢水排放標(biāo)準(zhǔn)制定提供理論支持,同時(shí)可為水生動(dòng)物生態(tài)毒理學(xué)的研究積累基礎(chǔ)資料。2.2不同環(huán)境因子影響下Chemonsensory基因的表達(dá)的差異環(huán)境感應(yīng)蛋白屬于一類保守的蛋白家族,對(duì)環(huán)境因子的變化敏感。在本實(shí)驗(yàn)所設(shè)高溫,低溫以及不同濃度CdCl2處理等環(huán)境因子誘導(dǎo)下,與內(nèi)參基因（核糖體L8）相比,環(huán)境感應(yīng)

10、蛋白的表達(dá)量除高溫組均有不同幅度升高。高溫可使Chemonsensory2和Chemonsensory3的相對(duì)表達(dá)量稍稍降低,低溫可使Chemonsensory2和Chemonsensory3的相對(duì)表達(dá)量大幅度升高。兩種環(huán)境感應(yīng)蛋白的相對(duì)表達(dá)量都會(huì)隨著CdCl2濃度的升高而升高。兩種蛋白各自在孤雌溞和兩性種體內(nèi)的相對(duì)表達(dá)量相同。Chemonsensory3的表達(dá)水平總體高于Chemonsensory2。這表明環(huán)境感應(yīng)蛋白在不良環(huán)境脅迫下