小鼠肝干細胞的識別鑒定及其分化譜系的研究.pdf

1、組織干細胞對于哺乳動物機體穩(wěn)態(tài)的維持具有重要意義，然而肝臟作為體內最重要的消化器官之一，成體肝臟干細胞怎樣參與肝臟細胞的更替與修復卻是領域內未解決的基本問題，甚至“肝干細胞是否存在”也一直備受爭議。研究成體肝干細胞的主要困難有:首先成熟肝細胞本身具有極強的復制能力，在肝臟遭受機械性損傷或者切除時，肝細胞可自我復制，完成肝臟修復;并且這種修復并不只是局限于一次損傷，有研究證明經歷了連續(xù)十二次肝切手術的大鼠，其肝臟仍可恢復至原來程度。其次，

2、肝臟和肌肉組織、神經組織類似屬于高度慢性更替組織，在正常生理狀態(tài)下小鼠肝細胞壽命可維持300天左右，因此研究肝干細胞對肝臟的貢獻有著較長的時間跨度;而且隨著這300天的進程，小鼠已步入衰老狀態(tài)，肝干細胞是否也會隨著機體而衰老導致不參與細胞更替，都是未知的。第三，現有的標志物并不能嚴格的區(qū)分膽管上皮細胞和肝干細胞，而只是籠統(tǒng)的包括在內，給追蹤肝干細胞命運造成很大難度和一定程度的偏向性;甚至有人認為Lgr5、CD133等肝干細胞標志物會不同

3、程度的丟失，導致目的細胞“失聯”。第四，不同實驗室研究肝干細胞時所采用的模型均不一致，有急性損傷比如三分之二肝切手術、四氯化碳注射、膽管結扎，也有慢性藥物損傷包括DDC（3，5-diethoxycarbonyl-1，4-dihydrocollidine，1，4-二氫-3，5-吡啶二甲酸二乙酯）飼料、CDE飲食（膽堿缺乏、甲硫氨酸補充飼料）、肝纖維化等等;這些模型之間的差異直接導致了所觀察的目的細胞在響應不同損傷時的差別，無疑增加了研究肝

4、干細胞的復雜程度。第五，在人類的許多肝臟疾病中，均可觀察到被稱為“膽管反應”的現象，也就是肝臟實質有許多“膽管細胞樣”細胞的出現，這些細胞究竟是什么、起何作用仍是未知的?？偨Y這些因素來看，缺少特異的肝干細胞標志物、不同損傷模型之間的差異、肝實質損傷程度、肝干細胞和人類肝病的關系是肝干細胞研究領域的核心。本課題圍繞“肝干細胞是什么”這一領域內基本問題開展研究，試圖揭開這一神秘面具并未將來肝干細胞的臨床應用提供線索和奠定基礎。
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5、對目前肝干細胞研究領域的不足，本研究采用了對肝臟中各類細胞的單細胞深度測序方法，來解決這一問題。首先，利用Cre/LoxP示蹤小鼠體系來示蹤細胞的命運?；谥暗膱蟮?，肝干細胞的共性是表達角蛋白19(Krt19)，因此使用了八周齡的Krt19CreERT/Rosa26R-GFP示蹤小鼠進行腹腔注射4毫克他莫昔芬(tamoxifen)，來觀察表達或者曾經表達Krt19細胞的命運。誘導兩天后檢測小鼠綠色熒光蛋白(GFP)表達情況或者開始進行

6、損傷;對他莫昔芬誘導后兩天的小鼠進行急性損傷（腹腔注射1微升/克體重的四氯化碳）和慢性肝損(含有1％DDC(w/w)的飼料飼喂3周）處理。第二是Krt19譜系細胞的分選、單細胞建庫、深度測序和轉錄組分析。使用流式細胞分選(FACS)方法，將示蹤小鼠肝臟的GFP陽性細胞分選后，挑選單個細胞，構建每個細胞單獨的cDNA文庫(cDNA libraries);利用已知標志物對每個單細胞進行聚合酶鏈式反應(PCR，Polymerase Chain

7、 Reaction)鑒定，初步判斷細胞的身份;對候選細胞進行深度測序;測序數據經映射至小鼠轉錄組(mm9)后進行無監(jiān)督的層級聚類分析(unsupervised hierarchical clustering analysis)、加權基因共表達網絡分析(WGCNA)和差異表達基因分析（differential expression analysis）。第三，針對單細胞轉錄組分析結果，將候選細胞分類，繪制肝干細胞分化圖譜，篩選得到候選肝干細

8、胞表面標志物及其活化相關因子。最后，對篩到的候選相關標志物和活化因子進行實驗驗證。
　　該研究得到的主要結果包括:1）通過觀察Krt19CreERT/Rosa26R-GFP示蹤小鼠肝臟中GFP陽性細胞的命運，發(fā)現Krt19譜系細胞可以標記肝臟內的膽管細胞、肝細胞和潛在的干細胞。2）將小鼠中Krt19譜系細胞通過流式細胞分選儀分選下來，進行單細胞挑選，共計得到了1094個單細胞;我們構建了每個單細胞的cDNA文庫，利用已報道的相關標

9、志物進行經鑒定后，選取了39個候選細胞（包括潛在的干細胞、肝向分化細胞和膽管細胞）并進行單細胞深度測序和轉錄組分析。3）根據39個細胞的轉錄組特征可以將得到的細胞分為六群，分別是:靜息、活化的兩類肝干細胞，肝前體細胞，不成熟肝細胞，成熟肝細胞，膽管細胞。4）根據各群細胞的轉錄組特點，重構了肝干細胞分化圖譜、描繪了各群細胞的分子標簽、篩選得到了肝干細胞的特異表面標志物CD63、CD56以及激活靜息肝干細胞的關鍵通路:VEGF和MAPK。5

10、）通過原位染色、體外培養(yǎng)、細胞移植和體內示蹤實驗，證明了CD63是全新的肝干細胞表面標志物。6）CD56可以區(qū)分肝臟中靜息和活化的肝干細胞:CD63+CD56+是活化的肝干細胞，CD63+CD56-是靜息的肝干細胞。7）生長因子VEGF和bFGF，作為VEGF和MAPK兩條通路的關鍵調控因子，可以激活靜息的肝干細胞。
　　總的來說，通過小鼠肝臟的單細胞轉錄組分析，描繪了小鼠肝干細胞的分化譜系，得到了小鼠肝臟中每類細胞中特異表達的標