小鼠肝干細(xì)胞的識別鑒定及其分化譜系的研究.pdf

1、組織干細(xì)胞對于哺乳動物機體穩(wěn)態(tài)的維持具有重要意義，然而肝臟作為體內(nèi)最重要的消化器官之一，成體肝臟干細(xì)胞怎樣參與肝臟細(xì)胞的更替與修復(fù)卻是領(lǐng)域內(nèi)未解決的基本問題，甚至“肝干細(xì)胞是否存在”也一直備受爭議。研究成體肝干細(xì)胞的主要困難有:首先成熟肝細(xì)胞本身具有極強的復(fù)制能力，在肝臟遭受機械性損傷或者切除時，肝細(xì)胞可自我復(fù)制，完成肝臟修復(fù);并且這種修復(fù)并不只是局限于一次損傷，有研究證明經(jīng)歷了連續(xù)十二次肝切手術(shù)的大鼠，其肝臟仍可恢復(fù)至原來程度。其次，

2、肝臟和肌肉組織、神經(jīng)組織類似屬于高度慢性更替組織，在正常生理狀態(tài)下小鼠肝細(xì)胞壽命可維持300天左右，因此研究肝干細(xì)胞對肝臟的貢獻(xiàn)有著較長的時間跨度;而且隨著這300天的進(jìn)程，小鼠已步入衰老狀態(tài)，肝干細(xì)胞是否也會隨著機體而衰老導(dǎo)致不參與細(xì)胞更替，都是未知的。第三，現(xiàn)有的標(biāo)志物并不能嚴(yán)格的區(qū)分膽管上皮細(xì)胞和肝干細(xì)胞，而只是籠統(tǒng)的包括在內(nèi)，給追蹤肝干細(xì)胞命運造成很大難度和一定程度的偏向性;甚至有人認(rèn)為Lgr5、CD133等肝干細(xì)胞標(biāo)志物會不同

3、程度的丟失，導(dǎo)致目的細(xì)胞“失聯(lián)”。第四，不同實驗室研究肝干細(xì)胞時所采用的模型均不一致，有急性損傷比如三分之二肝切手術(shù)、四氯化碳注射、膽管結(jié)扎，也有慢性藥物損傷包括DDC（3，5-diethoxycarbonyl-1，4-dihydrocollidine，1，4-二氫-3，5-吡啶二甲酸二乙酯）飼料、CDE飲食（膽堿缺乏、甲硫氨酸補充飼料）、肝纖維化等等;這些模型之間的差異直接導(dǎo)致了所觀察的目的細(xì)胞在響應(yīng)不同損傷時的差別，無疑增加了研究肝

4、干細(xì)胞的復(fù)雜程度。第五，在人類的許多肝臟疾病中，均可觀察到被稱為“膽管反應(yīng)”的現(xiàn)象，也就是肝臟實質(zhì)有許多“膽管細(xì)胞樣”細(xì)胞的出現(xiàn)，這些細(xì)胞究竟是什么、起何作用仍是未知的?？偨Y(jié)這些因素來看，缺少特異的肝干細(xì)胞標(biāo)志物、不同損傷模型之間的差異、肝實質(zhì)損傷程度、肝干細(xì)胞和人類肝病的關(guān)系是肝干細(xì)胞研究領(lǐng)域的核心。本課題圍繞“肝干細(xì)胞是什么”這一領(lǐng)域內(nèi)基本問題開展研究，試圖揭開這一神秘面具并未將來肝干細(xì)胞的臨床應(yīng)用提供線索和奠定基礎(chǔ)。
　　針

5、對目前肝干細(xì)胞研究領(lǐng)域的不足，本研究采用了對肝臟中各類細(xì)胞的單細(xì)胞深度測序方法，來解決這一問題。首先，利用Cre/LoxP示蹤小鼠體系來示蹤細(xì)胞的命運?；谥暗膱蟮?，肝干細(xì)胞的共性是表達(dá)角蛋白19(Krt19)，因此使用了八周齡的Krt19CreERT/Rosa26R-GFP示蹤小鼠進(jìn)行腹腔注射4毫克他莫昔芬(tamoxifen)，來觀察表達(dá)或者曾經(jīng)表達(dá)Krt19細(xì)胞的命運。誘導(dǎo)兩天后檢測小鼠綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)情況或者開始進(jìn)行

6、損傷;對他莫昔芬誘導(dǎo)后兩天的小鼠進(jìn)行急性損傷（腹腔注射1微升/克體重的四氯化碳）和慢性肝損(含有1％DDC(w/w)的飼料飼喂3周）處理。第二是Krt19譜系細(xì)胞的分選、單細(xì)胞建庫、深度測序和轉(zhuǎn)錄組分析。使用流式細(xì)胞分選(FACS)方法，將示蹤小鼠肝臟的GFP陽性細(xì)胞分選后，挑選單個細(xì)胞，構(gòu)建每個細(xì)胞單獨的cDNA文庫(cDNA libraries);利用已知標(biāo)志物對每個單細(xì)胞進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR，Polymerase Chain

7、 Reaction)鑒定，初步判斷細(xì)胞的身份;對候選細(xì)胞進(jìn)行深度測序;測序數(shù)據(jù)經(jīng)映射至小鼠轉(zhuǎn)錄組(mm9)后進(jìn)行無監(jiān)督的層級聚類分析(unsupervised hierarchical clustering analysis)、加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(WGCNA)和差異表達(dá)基因分析（differential expression analysis）。第三，針對單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果，將候選細(xì)胞分類，繪制肝干細(xì)胞分化圖譜，篩選得到候選肝干細(xì)

8、胞表面標(biāo)志物及其活化相關(guān)因子。最后，對篩到的候選相關(guān)標(biāo)志物和活化因子進(jìn)行實驗驗證。
　　該研究得到的主要結(jié)果包括:1）通過觀察Krt19CreERT/Rosa26R-GFP示蹤小鼠肝臟中GFP陽性細(xì)胞的命運，發(fā)現(xiàn)Krt19譜系細(xì)胞可以標(biāo)記肝臟內(nèi)的膽管細(xì)胞、肝細(xì)胞和潛在的干細(xì)胞。2）將小鼠中Krt19譜系細(xì)胞通過流式細(xì)胞分選儀分選下來，進(jìn)行單細(xì)胞挑選，共計得到了1094個單細(xì)胞;我們構(gòu)建了每個單細(xì)胞的cDNA文庫，利用已報道的相關(guān)標(biāo)

9、志物進(jìn)行經(jīng)鑒定后，選取了39個候選細(xì)胞（包括潛在的干細(xì)胞、肝向分化細(xì)胞和膽管細(xì)胞）并進(jìn)行單細(xì)胞深度測序和轉(zhuǎn)錄組分析。3）根據(jù)39個細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組特征可以將得到的細(xì)胞分為六群，分別是:靜息、活化的兩類肝干細(xì)胞，肝前體細(xì)胞，不成熟肝細(xì)胞，成熟肝細(xì)胞，膽管細(xì)胞。4）根據(jù)各群細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組特點，重構(gòu)了肝干細(xì)胞分化圖譜、描繪了各群細(xì)胞的分子標(biāo)簽、篩選得到了肝干細(xì)胞的特異表面標(biāo)志物CD63、CD56以及激活靜息肝干細(xì)胞的關(guān)鍵通路:VEGF和MAPK。5

10、）通過原位染色、體外培養(yǎng)、細(xì)胞移植和體內(nèi)示蹤實驗，證明了CD63是全新的肝干細(xì)胞表面標(biāo)志物。6）CD56可以區(qū)分肝臟中靜息和活化的肝干細(xì)胞:CD63+CD56+是活化的肝干細(xì)胞，CD63+CD56-是靜息的肝干細(xì)胞。7）生長因子VEGF和bFGF，作為VEGF和MAPK兩條通路的關(guān)鍵調(diào)控因子，可以激活靜息的肝干細(xì)胞。
　　總的來說，通過小鼠肝臟的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析，描繪了小鼠肝干細(xì)胞的分化譜系，得到了小鼠肝臟中每類細(xì)胞中特異表達(dá)的標(biāo)