β3GnT-8 siRNA的設計和篩選及該基因與胃癌侵襲轉移關系的初步研究.pdf

1、目的:β1,3葡萄糖基轉移酶8(β3Gn-T8),又名β1,3半乳糖基轉移酶7(β3GalT7),是本課題組首先在國際上克隆獲得的人類糖基轉移酶新基因。已有研究表明該酶可能與腫瘤侵襲轉移相關。本文通過生物信息學方法分析了B3Gn-T8與癌癥浸潤轉移相關基因的聯系,并且通過RNA干擾技術和真核正義表達載體技術研究了β3Gn-T8對人胃癌細胞AGS中相關基因表達的調節(jié)作用,以期為胃癌治療提供新的途徑。
　　 方法:
　　 1

2、.遵循RNA干擾目標序列的選取原則,利用互聯網資源對β3Gn-T8基因mRNA序列設計三條可能的小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA),通過RNAi-mate介導轉染入人胃癌細胞AGS中,設計梯度轉染體系,以最高轉染效率和最低細胞死亡率為原則,優(yōu)化siRNA轉染.AGS細胞的條件。收集轉染48 h后的細胞,采用H-E染色觀察細胞形態(tài)學變化,RT-PCR.,Real time-PCR法檢測β3Gn-T8基因

3、在轉錄水平的改變；western blot檢測β3 Gn-T8在蛋白水平的改變。確定最有效的siRNA序列。通過流式細胞術和Hoechst33258檢測AGS細胞凋亡,MTT。比色法檢測有效siRNA對AGS細胞增殖的影響。
　　 2.從β3GnT家族和β3GalT家族中篩選出與β3GnT-8有較高同源性的基因。通過生物信息學方法篩選出與該同源基因有相互作用的與癌癥浸潤轉移相關的基因,并預測β3Gn-T8與這些基因的作用。

4、>　　 3.轉染有效β3GnT8 siRNA和pEGFP-C1-β13Gn-T8正義真核表達載體,檢測與癌癥浸潤轉移相關基因mRNA水平和蛋白水平表達,明膠酶譜法測酶活,Transwell法檢測.AGS細胞侵襲能力變化。將隨機分成control組,siRNA組,pEGFP-C1-β3Gn-T8-sense組的裸鼠分別給予皮下接種以構建人胃癌細胞AGS異種裸鼠成瘤,在動物實體水平深入研究。
　　 結果:
　　 1.化學合

5、成三條siRNA分子轉染人AGS細胞株,綜合最高轉染效率與最低細胞死亡率的優(yōu)化原則,最終選擇每1×105個細胞100 nmol/L作為轉染siRNA的實驗濃度,并篩選出其中一條對β3Gn-T8基因抑制效率最高的siRNA序列。檢測出轉染了該有效siRNA的細胞中β3Gn-T8的mRNA和蛋白表達都受到了有效抑制,同時也引起AGS細胞凋亡,細胞增值受到抑制。
　　 2.經過同源性比對,β3Gn-T2與β3Gn-T8有較大同源性。從

6、數據庫中篩選出和β3Gn-T2有相互作用的與癌癥浸潤轉移相關基因,發(fā)現β3Gn-T2與MMP-2,TIMP-2具有很密切的相互作用,分析作用通路,發(fā)現轉錄因子ETS-1,Jun在其中起重要的調控作用。分析β3Gn-T8上游調控序列,找出轉錄起始點,預測啟動子區(qū)和轉錄因子,發(fā)現β3Gn-T8啟動子區(qū)有一個ETS-1和五個Jun結合位點,猜測β3GnT8與MMP-2,TIMP-2之間也存在一定的調控作用。
　　 3.分析了β3Gn-

7、T8和胃癌侵襲轉移的關系:轉染有效的siRNA后,MMP-2mRNA和蛋白表達均受到抑制,而TIMP-2的mRNA及蛋白質表達均有所升高；明膠酶譜法檢測出MMP2活性降低,細胞侵襲能力降低。轉染正義β3Gn-T8表達載體后,MMP-2 mRNA和蛋白表達均升高,而TIMP-2的mRNA及蛋白質表達均降低；明膠酶譜法檢測出MMP2活性升高,細胞侵襲能力提高。接種siRNA組的裸鼠成瘤時間明顯延長,成瘤率為100％,腫瘤體積和重量明顯小于接

8、種AGS組的裸鼠(P＜0.01)；接種pEGFP-C1-β3Gn-T8-sense組的裸鼠成瘤時間明顯縮短,成瘤率為100％,腫瘤體積和重量明顯大于接種AGS組的裸鼠(P＜0.01)。
　　 結論:采用生物信息學的方法設計出有效siRNA靶位點；siRNA能有效抑制AGS細胞中β3Gn-T8基因的表達,抑制細胞生長,促進細胞凋亡。同時,β3Gn-T8與MMP-2,TIMP-2的表達及腫瘤的侵襲轉移能力有一定的相關性,更深入的機制