馬鈴薯Y病毒N株系HC-Pro基因在畢赤酵母中分泌表達(dá)與鑒定及抗血清制備.pdf

1、馬鈴薯Y病毒屬成員是植物病毒中最大的被蚜蟲以非持久方式傳播的群體，馬鈴薯Y屬病毒HC-Pro蛋白為病毒自身編碼，在病毒生活史中體現(xiàn)出了多種不同功能。與很多已經(jīng)鑒定出HC-Pro功能不同的是，在蚜蟲傳毒研究中必須使用具有生物活性HC-Pro蛋白的參與。因此本文我們采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)來獲得具有生物活性的HC-Pro蛋白。 采用基因工程技術(shù)構(gòu)建酵母表達(dá)系統(tǒng)的重組表達(dá)質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)以

2、此表達(dá)目的蛋白，并對表達(dá)蛋白進(jìn)行鑒定。根據(jù)馬鈴薯Y病毒HC-Pro發(fā)表序列，設(shè)計1對引物。利用RT-PCR的方法，以感病植物葉片提取的RNA為模板，擴(kuò)增此基因。所得的DNA片段經(jīng)SnaBI和EcoRI雙酶切后用T4DNA連接酶與pPIC9K載體進(jìn)行連接，然后導(dǎo)入大腸桿菌DH5a，用PCR法篩選陽性轉(zhuǎn)化子，并用雙酶切和序列測定方法鑒定重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒線性化后，用電擊法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入巴氏畢赤酵母，在缺組氨酸的MD板上篩選陽性菌落，然后用

3、不同濃度的G418-YPD板篩選多拷貝插入單菌落。培養(yǎng)多拷貝插入的酵母細(xì)胞，用甲醇誘導(dǎo)目的蛋白的分泌，SDS-PAGE和Westernblotting鑒定表達(dá)蛋白，免疫家兔制備抗血清。 PCR擴(kuò)增出兩端帶有SnaBI和EcoRI酶切位點的目的基因片段。目的基因經(jīng)雙酶切后連接載體pPIC9K，然后導(dǎo)入大腸桿菌DH5a中，在含氨卞青霉素(AMP)的卡那霉素(Kan)LB板上用PCR反應(yīng)篩選出陽性菌落，雙酶切結(jié)果表明目的基因已插入載體

4、中，且方向正確，測序結(jié)果進(jìn)一步證明馬鈴薯Y病毒HC-Pro基因表達(dá)質(zhì)粒成功地克隆了目的基因片段。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化巴氏畢赤酵母，G418篩選出多拷貝插入的單克隆，多拷貝插入的單克隆酵母細(xì)胞經(jīng)搖瓶發(fā)酵和1％甲醇誘導(dǎo)后，SDS-PAGE檢測發(fā)酵液上清，在66KD處有一特異條帶表達(dá)，目的條帶蛋白占上清液總蛋白的40％。純化后的HC-Pro蛋白免疫家兔，獲得了效價為1：256的高價血清。Westernblot鑒定表明，表達(dá)蛋白可以和兔抗HC多抗發(fā)生結(jié)