靛玉紅衍生物PHⅡ-7誘導(dǎo)乳腺癌耐藥株MCF-7-ADR凋亡并通過轉(zhuǎn)錄因子AP-1逆轉(zhuǎn)其多藥耐藥.pdf

1、靛玉紅衍生物PHⅡ-7誘導(dǎo)乳腺癌耐藥株MCF-7/ADR凋亡并通過轉(zhuǎn)錄因子AP-1逆轉(zhuǎn)其多藥耐藥
　　 乳腺癌是女性易患的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居女性腫瘤第二位，且呈逐年上升趨勢，嚴(yán)重危害廣大婦女的健康?；熓桥R床上常用的治療手段，但多藥耐藥(Multidrug resistance，MDR)仍是導(dǎo)致乳腺癌化療失敗的重要原因之一。
　　 MDR形成機(jī)制復(fù)雜，其中P—糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)的過表達(dá)介

2、導(dǎo)的藥物外排作用是主要的耐藥機(jī)制。P-gp屬于ATP結(jié)合盒(ATP-binding cassette，ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員之一，由mdr1基因編碼，是一種相對分子質(zhì)量為170KDa的跨膜糖蛋白。P-gp的過度表達(dá)形成藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)泵，可與細(xì)胞內(nèi)化療藥物結(jié)合并將藥物泵到細(xì)胞外，以維持細(xì)胞內(nèi)藥物濃度在亞致死量的范圍，從而產(chǎn)生耐藥性。在大約30-40％的原發(fā)性乳腺癌和多于50％的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者P-gp都高表達(dá)，因此研制能抑制P-gp表達(dá)及

3、其功能的新型抗癌藥是目前研究的熱點(diǎn)。目前被證實(shí)具有逆轉(zhuǎn)P-gp介導(dǎo)的MDR作用的藥物和制劑很多，如維拉帕米（verapamil）、環(huán)胞多肽(cyclosporine)、三氟拉嗪(trifluroperazine)等，由于其有效逆轉(zhuǎn)濃度往往超出臨床應(yīng)用的安全范圍，在臨床推廣中存在不足。因此，尋找高效、低毒、作用靶點(diǎn)廣、逆轉(zhuǎn)作用顯著的腫瘤MDR逆轉(zhuǎn)劑刻不容緩。
　　 近期，人們發(fā)現(xiàn)一些傳統(tǒng)中藥在作為抗癌藥同時(shí)具有逆轉(zhuǎn)耐藥效應(yīng)，相對于

4、西藥，因其有效性和安全性而受到青睞。靛玉紅是傳統(tǒng)中藥(tranditional Chinese medicine，TCM)復(fù)方“當(dāng)歸龍薈丸”（danggui longhui wan）的活性成分。在中國，當(dāng)歸龍薈丸被用于治療慢性粒細(xì)胞性白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)。靛玉紅的確切作用機(jī)制雖尚不清楚，但其對CML的治療取得了令人欣慰的結(jié)果，同時(shí)抗實(shí)體瘤的效應(yīng)也被研究。研究表明，靛玉紅衍生物對多種人

5、類腫瘤細(xì)胞也具有抗癌作用。一些靛玉紅衍生物，如indirubin-5-sulfonate和indirubin-3-monoxime臨床試驗(yàn)已取得可喜成績?；诘逵窦t屬于氧化吲哚類這一事實(shí)，我們設(shè)計(jì)和合成了一系列的氧化吲哚類衍生物:Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ類，并經(jīng)過構(gòu)效分析，最終得到了抗癌效應(yīng)最強(qiáng)的化合物:PHⅡ-7。
　　 前期研究發(fā)現(xiàn)，PHⅡ-7可抑制多種人腫瘤細(xì)胞生長，對多藥耐藥腫瘤細(xì)胞同樣有效，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)對多種移植瘤有效。PHⅡ-7的

6、一個主要的特征就是對多藥耐藥的腫瘤細(xì)胞同樣有效。本實(shí)驗(yàn)選用乳腺癌敏感株MCF-7和高表達(dá)P-gp的多藥耐藥細(xì)胞株MCF-7/ADR，觀察PHⅡ-7的抗癌和耐藥逆轉(zhuǎn)作用。結(jié)果表明，耐藥株MCF-7/ADR相對于敏感株MCF-7對ADR的耐藥倍數(shù)將近40倍，而PHⅡ-7對MCF-7/ADR和MCF-7均有生長抑制作用，IC50值接近，分別為6.07μM和5.51μM。用凋亡試劑盒Annexin-V FITC-PI測試結(jié)果表明，4μM的PHⅡ

7、-7可誘導(dǎo)MCF-7/ADR將近20％的凋亡率。MTT和凋亡結(jié)果表明，PHⅡ-7可以顯著抑制MCF-7/ADR細(xì)胞的增殖活性，并誘導(dǎo)其凋亡。
　　 用verapamil作為陽性對照，PHⅡ-7的逆轉(zhuǎn)活性被進(jìn)一步檢測。在非毒性的濃度0.5μM、1μM和2μM，PHⅡ-7明顯提高M(jìn)CF-7/ADR對ADR的敏感性，表現(xiàn)為IC50值的濃度依賴性降低。相對于verapamil的54.68的耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)，0.5μM、1μM和2μMPHⅡ-

8、7分別將MCF-7/ADR的IC50值137.80μM降至108.20μM，18.64μM和0.55μM，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為1.27，7.39，250.55。PHⅡ-7對MCF-7/ADR的逆轉(zhuǎn)機(jī)制尚不清楚，因此，接下來的實(shí)驗(yàn)主要檢測了PHⅡ-7對mdr1/P-gp的表達(dá)和外排功能的影響。
　　 Rhodamine123作為P-gp的熒光性底物，被用于檢測P-gp的外排泵功能。結(jié)果表明，同verapamil相同，(0.5μM，2μM

9、) PHⅡ-7可明顯增加MCF-7/ADR細(xì)胞內(nèi)Rhodamine123的蓄積量，但對敏感株MCF-7無明顯影響，提示PHⅡ-7可抑制P-gp的外排泵功能。進(jìn)一步的研究表明，經(jīng)PHⅡ-7作用后，MCF-7ADR細(xì)胞mdr1/P-gp表達(dá)明顯降低。流式細(xì)胞儀檢測對P-gp蛋白的檢測結(jié)果表明，10μM verapamil導(dǎo)致了25.83％的P-gp表達(dá)下調(diào)，而0.5μM、1μM、2μM和4μM PHⅡ-7對P-pg抑制率分別為1.35％、5

10、.39％、14.72％和25.87％。4μM PHⅡ-7對P-gp的抑制率同10μMverapamil接近，但2μM PHⅡ-7的逆轉(zhuǎn)效應(yīng)是10μM verapamil的4.58倍。對P-gp表達(dá)和功能的雙重抑制、誘導(dǎo)凋亡共同參與了PHⅡ-7的耐藥逆轉(zhuǎn)作用，強(qiáng)大的逆轉(zhuǎn)效應(yīng)保證了其應(yīng)用的安全性。
　　 mdr1在轉(zhuǎn)錄水平可被多個轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)?；罨鞍?1(activating protein-1，AP-1)是調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)的重要的轉(zhuǎn)

11、錄因子之一，由Fos和Jun蛋白家族的二聚體組成。AP-1是多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵因子，在細(xì)胞分化、增生、凋亡過程中都起非常重要的作用。在乳腺癌細(xì)胞，AP-1已被證實(shí)為乳腺癌浸潤和轉(zhuǎn)移的重要的調(diào)節(jié)因子。此外，其他幾條證據(jù)也使我們?nèi)フ{(diào)查AP-1在mdr1轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中的可能作用:(1)mdr1啟動子區(qū)包含AP-1的重復(fù)位點(diǎn)，且位于啟動子起始轉(zhuǎn)錄所必須的區(qū)域。(2)在幾株人多藥耐藥細(xì)胞上已證實(shí)了c-fos、c-jun的過表達(dá)和AP-1活性的增

12、強(qiáng)。AP-1活性的降低可增加對抗癌藥的敏感性，提示了AP-1在MDR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要作用。
　　 作為AP-1的組成成分之一，c-fos在腫瘤發(fā)生、腫瘤細(xì)胞增生、轉(zhuǎn)化、血管生成、腫瘤浸和轉(zhuǎn)移中起非常重要的作用。在乳腺癌，c-fos的過度表達(dá)和預(yù)后成反比。c-fos基因的敲除能夠延長乳腺癌移植瘤的存活時(shí)間，抑制乳腺癌細(xì)胞的增生和浸潤。而且，研究表明，一些用于誘導(dǎo)多藥耐藥的藥物如阿霉素、長春新堿(vincristine)、依托泊

13、甙(VP-16)和秋水仙堿(colchicine)，在應(yīng)用過程中也引起c-fos表達(dá)水平的升高。這提示在多藥耐藥形成早期，轉(zhuǎn)錄機(jī)制的加強(qiáng)促進(jìn)了P-gp表達(dá)增高。
　　 相對于敏感株MCF-7，耐藥株MCF-7/ADR高表達(dá)c-fos mRNA和蛋白。而PHⅡ-7以時(shí)間和濃度依賴性的方式抑制MCF-7/ADR細(xì)胞的c-fos表達(dá)。4μM PHⅡ-7處理MCF-7/ADR24h后，c-fos蛋白水平明顯下降，這和4μM PHⅡ-7對

14、P-gp25.87％的抑制率相一致。為進(jìn)一步確證c-fos在P-gp介導(dǎo)的多藥耐藥中的作用，用重組的干擾載體pSilencer3.1/ sic-fos轉(zhuǎn)染MCF-7/ADR細(xì)胞，干擾c-fos基因。并篩選出兩株穩(wěn)定單克隆細(xì)胞，MCF-7/ADR/sic-fos-8B和-3D，觀察c-fos基因的抑制引起的耐藥性的變化。轉(zhuǎn)染結(jié)果表明，c-fos基因的抑制可下調(diào)mdr1和P-gp的表達(dá)，增加細(xì)胞內(nèi)的Rhodamine123蓄積量，對ADR的

15、敏感性增加。和c-fos的干擾程度相一致，MCF-7/ADR/sic-fos-3D因?yàn)閏-fos干擾得更明顯，因此表現(xiàn)出對ADR更強(qiáng)的敏感性、更多的細(xì)胞內(nèi)Rhodamine123的蓄積、較少的mdr1/P-gp表達(dá)，這些結(jié)果更進(jìn)一步確定了c-fos對P-gp介導(dǎo)的多藥耐藥的調(diào)節(jié)作用。
　　 綜上所述，PHⅡ-7作為靛玉紅衍生物之一，一方面可誘導(dǎo)耐藥的乳腺癌細(xì)胞凋亡，另一方面可通過抑制轉(zhuǎn)錄因子AP-1，下調(diào)P-gp表達(dá)，逆轉(zhuǎn)MCF