Mk-2206逆轉(zhuǎn)MCF-7-ADR阿霉素耐藥作用的初步探討.pdf

1、背景：
　　乳腺癌是威脅婦女身心健康的常見惡性腫瘤，目前發(fā)病率排在女性惡性腫瘤的第一位，死亡率排在第六位?；熓侨橄侔┚C合治療的重要步驟之一，但化療可以使乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥，從而導(dǎo)致化療失敗。研究表明磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K）/蛋白激酶B(protein kinaseB，PKB)(AKT)信號(hào)傳導(dǎo)通路的激活參與了乳腺癌的多藥耐藥過(guò)程。因此，PI3K-AKT信號(hào)通路

2、被認(rèn)為是重要的乳腺癌治療靶點(diǎn)，一些PI3K-AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路的小分子抑制劑已經(jīng)進(jìn)入臨床研究階段，在乳腺癌的靶向治療方面顯示出了良好的應(yīng)用前景。MK-2206是人工合成的高選擇性非ATP競(jìng)爭(zhēng)的特異性的新型小分子AKT抑制劑，在多種腫瘤中都顯示出了較好的腫瘤抑制效果，目前已進(jìn)入到Ⅱ期臨床研究階段。
　　目的：
　　本實(shí)驗(yàn)以乳腺癌MCF-7和MCF-7/ADR細(xì)胞為研究對(duì)象，在細(xì)胞水平初步探討MK-2206對(duì)其殺傷及逆轉(zhuǎn)作用，驗(yàn)

3、證拮抗p-(Thr246)PRAS40的表達(dá)能否部分逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞的阿霉素耐藥，為乳腺癌的臨床用藥提供依據(jù)。
　　方法：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng):培養(yǎng)人乳腺癌MCF-7和MCF-7/ADR細(xì)胞，阿霉素維持濃度為1ug/mL。實(shí)驗(yàn)前兩周，對(duì)MCF-7/ADR進(jìn)行無(wú)藥培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　2.CCK-8檢測(cè):利用CCK-8法檢測(cè)阿霉素和MK-2206對(duì)MCF-7和MCF-7/ADR的細(xì)胞毒性、耐藥倍數(shù)以及MK-2

4、206逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADR耐藥的作用。
　　3.流式細(xì)胞儀檢測(cè):利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)無(wú)毒劑量的MK-2206聯(lián)合阿霉素作用于MCF-7/ADR細(xì)胞后，其凋亡率的變化以及MCF-7/ADR細(xì)胞內(nèi)阿霉素含量的變化。
　　4.Western blot檢測(cè):利用Western blot法檢測(cè)p-(Thr246)PRAS40、p-(Thr308)AKT和P-gp蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.不同濃度的阿霉素和MK-22

5、06均對(duì)MCF-7和MCF-7/ADR細(xì)胞有抑制增殖的作用，且呈劑量依賴性。無(wú)毒劑量的MK-2206與阿霉素合用后，MCF-7和MCF-7/ADR對(duì)阿霉素的IC50均有不同程度的下降，但以MCF-7/ADR的下降更明顯，不同濃度MK-2206干預(yù)后的阿霉素IC50與單用阿霉素的IC50之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　2.AnnexinⅤ-FITC雙染法結(jié)果顯示濃度分別為0、5、10nmol/L的MK-2206聯(lián)合阿霉

6、素作用于MCF-7/ADR細(xì)胞24H后，可不同程度提高細(xì)胞凋亡率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。但在耐藥細(xì)胞阿霉素含量的測(cè)定上，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　3.Western blot結(jié)果顯示，MCF-7中P-PRAS40、P-AKT和P-gp蛋白的表達(dá)水平均明顯低于MCF-7/ADR細(xì)胞。無(wú)毒劑量的MK-2206處理24H后，可以下調(diào)MCF-7/ADR細(xì)胞p-(Thr246) PRAS40和