封裝VEGF及bFGF的海藻酸鈉凝膠負(fù)荷內(nèi)皮祖細(xì)胞修復(fù)大鼠皮膚創(chuàng)面的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分、海藻酸鈉凝膠的制備及對(duì)成血管因子的封裝
　　目的：設(shè)計(jì)并合成具有一定生物活性的海藻酸鈉凝膠，觀察其顯微結(jié)構(gòu)；并封裝成血管生長(zhǎng)因子VEGF和bFGF，測(cè)定并比較海藻酸鈉對(duì)這兩種生長(zhǎng)因子的釋放規(guī)律。
　　方法：購(gòu)買天然的高分子量及低分子量海藻酸鈉大分子，通過(guò)高碘酸鈉氧化修飾法部分氧化海藻酸鈉分子；氧化型的高分子量及低分子量海藻酸鈉溶解后，按照1:1等體積混合后，在二價(jià)鈣離子的作用下發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)形成凝膠，掃描電鏡下觀察其

2、顯微結(jié)構(gòu)；同時(shí)加入VEGF及bFGF一起形成凝膠，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)測(cè)定兩種因子的釋放規(guī)律。
　　結(jié)果：成功合成了海藻酸鈉凝膠，并完成了凝膠對(duì)VEGF及bFGF的封裝。掃描電鏡下顯示凝膠內(nèi)部呈多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，孔隙直徑在10μm左右；ELISA結(jié)果顯示：短時(shí)程內(nèi)，兩種生長(zhǎng)因子都平穩(wěn)緩慢釋放，在24h時(shí)釋放率達(dá)到20％左右；長(zhǎng)時(shí)程內(nèi)，兩種生長(zhǎng)因子釋放速度也較平穩(wěn)，第七天時(shí)釋放速度明顯加快，釋放率達(dá)到85%左右。采用配對(duì)資料的t檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)

3、，海藻酸鈉凝膠對(duì)兩種生長(zhǎng)因子的釋放率沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論：海藻酸鈉能夠形成凝膠，而且能封裝生長(zhǎng)因子VEGF和bFGF；封裝后，能較平穩(wěn)釋放生長(zhǎng)因子，在一周左右有一個(gè)釋放高峰；海藻酸鈉能保證兩種生長(zhǎng)因子的協(xié)同釋放。
　　第二部分、內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離培養(yǎng)鑒定及與海藻酸鈉凝膠的負(fù)荷
　　目的：分離培養(yǎng)大鼠骨髓來(lái)源內(nèi)皮祖細(xì)胞，觀察內(nèi)皮祖細(xì)胞的生物特點(diǎn)，并鑒定其表面標(biāo)志物；用海藻酸鈉凝膠封裝VEGF及bFGF，同時(shí)負(fù)荷內(nèi)皮祖

4、細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察海藻酸鈉凝膠對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。
　　方法：分離SD大鼠骨髓，采用密度梯度離心法獲得單個(gè)核細(xì)胞；用EGM培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)，根據(jù)差速貼壁原理，分別獲得早、晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞；倒置顯微鏡下觀察兩種內(nèi)皮祖細(xì)胞的原代生長(zhǎng)規(guī)律；晚期內(nèi)皮組細(xì)胞經(jīng)傳代培養(yǎng)后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其表面標(biāo)記 CD34及 VEGFR2的陽(yáng)性率，免疫熒光法觀察這兩種表面分子的染色情況。使用封裝有VEGF及bFGF的海藻酸鈉凝膠負(fù)荷內(nèi)皮祖細(xì)胞，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)法

5、觀察內(nèi)皮祖細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)及與凝膠共培養(yǎng)時(shí)的生長(zhǎng)速度。
　　結(jié)果：我們成功分離培養(yǎng)了大鼠骨髓來(lái)源的內(nèi)皮祖細(xì)胞：早期內(nèi)皮組細(xì)胞在種植兩天后貼壁，四天左右開始出現(xiàn)“集落”，一周時(shí)觀察到典型的“內(nèi)皮祖細(xì)胞集落”，其特點(diǎn)是中央為大量圓球形細(xì)胞，周圍梭形細(xì)胞呈放射狀排列；晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞在第五日二次貼壁后呈圓球形，之后大量擴(kuò)增，兩周時(shí)達(dá)到80%融合，呈典型的“鋪路石”樣外觀。免疫熒光檢測(cè)顯示內(nèi)皮祖細(xì)胞VEGFR染色較強(qiáng)，而CD34分子染色較弱；流

6、式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示VEGFR2和CD34雙陽(yáng)性細(xì)胞比例為（1.50±0.04）%；VEGFR2單陽(yáng)性細(xì)胞比例為（18.50±0.12）%；CD34單陽(yáng)性細(xì)胞比例為（2.41±0.08）%。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)試顯示與單純內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)相比，海藻酸鈉凝膠共培養(yǎng)使細(xì)胞增殖更平穩(wěn)，增殖期延長(zhǎng)。
　　結(jié)論：密度梯度離心法結(jié)合差速貼壁原理能夠獲得穩(wěn)定傳代的大鼠骨髓來(lái)源內(nèi)皮祖細(xì)胞，為后續(xù)的組織工程研究提供“種子細(xì)胞”；海藻酸鈉凝膠與內(nèi)皮祖細(xì)胞有良好的

7、生物相容性，與VEGF及bFGF一起可以促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。
　　第三部分、封裝成血管因子VEGF及bFGF的海藻酸鈉凝膠負(fù)荷內(nèi)皮祖細(xì)胞在大鼠皮膚創(chuàng)面模型中促血管生成的效果的觀察
　　目的：觀察封裝成血管因VEGF及bFGF的海藻酸鈉凝膠，負(fù)荷大鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞在大鼠皮膚創(chuàng)面模型中促血管生成的效果，并探討其可能的機(jī)制。
　　方法：取SD大鼠24只，隨機(jī)分為A、B、C、D四組，設(shè)計(jì)大鼠背部創(chuàng)面模型；A組大鼠背部創(chuàng)面移

8、植單純的海藻酸鈉凝膠，B組大鼠背部創(chuàng)面移植封裝有VEGF及bFGF的海藻酸鈉凝膠，C組大鼠背部創(chuàng)面移植負(fù)荷有內(nèi)皮祖細(xì)胞的海藻酸鈉凝膠，D組大鼠背部創(chuàng)面移植封裝有VEGF及bFGF、同時(shí)負(fù)荷內(nèi)皮祖細(xì)胞的海藻酸鈉凝膠。連續(xù)大體觀比較創(chuàng)面愈合的基本情況；術(shù)后7天時(shí)，活體成像顯微鏡下觀察各組大鼠創(chuàng)面血管密度及血液供應(yīng)的基本情況；處死大鼠并分離創(chuàng)面組織，HE染色觀察創(chuàng)面的組織變化情況；免疫熒光法檢測(cè)各組創(chuàng)面 Ang-1及 VEGFR抗原的表達(dá)情況

9、；實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)創(chuàng)面組織中 PECAM1、VE-cadherin、Flk-1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。
　　結(jié)果：大體觀見(jiàn)D組大鼠創(chuàng)面造模后4天傷口已明顯干燥、結(jié)痂，在術(shù)后一周時(shí)形成了一層痂皮保護(hù)層，顯示創(chuàng)面愈合較其他組快；
　　活體成像顯微鏡結(jié)果示 A、B、C、D四組大鼠創(chuàng)面血管平均計(jì)數(shù)依次分別為（條）：4.0±0.8；12.5±1.3；14.0±0.8；27.8±2.5。A組的血管數(shù)與B、C、D組對(duì)比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（

10、P＜0.05）；D組的血管數(shù)與B、C組對(duì)比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。
　　A、B、C、D四組大鼠創(chuàng)面的平均血流速度依次分別為（μm/秒）：41.60±1.76；53.45±1.67；55.03±1.50；64.88±2.12。A的血流速度與 B、C、D組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；B、C組與D組對(duì)比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。
　　免疫熒光法顯示D組熒光強(qiáng)度最高。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示A、B、C、D四組大鼠創(chuàng)

11、面組織中PECAM的mRNA相對(duì)表達(dá)量依次為0.198±0.021；0.393±0.027；0.409±0.019；0.805±0.017。A組與B、C、D組對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；B、C組與D組對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　四組的VE-cadherin mRNA相對(duì)表達(dá)量依次為0.479±0.008；0.507±0.007；0.494±0.005；0.871±0.023。D組與A、B、C組對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；A、B

12、、C三組之間相互對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　四組的Flk-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量依次為0.186±0.017；0.406±0.010；0.404±0.008；0.690±0.020。A組與B、C、D組對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；B、C組與D組對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：封裝VEGF及bFGF的海藻酸鈉凝膠，同時(shí)負(fù)荷內(nèi)皮祖細(xì)胞用于大鼠背部創(chuàng)面的損傷修復(fù)，在宏觀上可以促進(jìn)創(chuàng)面的結(jié)痂及炎癥反應(yīng)的消退