HA1077促進骨髓間充質(zhì)干細胞修復皮膚創(chuàng)面的研究.pdf

1、背景:
　　 皮膚是人體面積最大的器官,是機體與外界的機械屏障,具有復雜的組織結(jié)構(gòu)和多重生理功能。創(chuàng)(燒)傷后皮膚缺損或是糖尿病等慢性病所致頑固性皮膚潰瘍是臨床常見病癥之一,及時有效的創(chuàng)面修復是此類患者救治的基礎(chǔ)和核心問題。隨著組織工程學的拓展,應用干細胞技術(shù)有望為創(chuàng)面修復提供新的手段。近年來,骨髓間充質(zhì)干細胞在創(chuàng)傷修復方面的作用日益受到各國學者的廣泛關(guān)注。
　　 骨髓間充質(zhì)干細胞具有高度自我更新能力以及多向分化潛能,多

2、項體內(nèi)外研究已證實其可以分化為成骨細胞、軟骨細胞、成纖維細胞、脂肪細胞、心肌細胞、肝細胞、神經(jīng)細胞等多種組織細胞。越來越多的學者傾向認同,骨髓間充質(zhì)干細胞能夠跨胚層分化為表皮細胞參與創(chuàng)面修復。然而,目前研究主要集中在骨髓間質(zhì)干細胞的分化結(jié)果上,對于分化中的信號調(diào)控機制研究甚少,骨髓間充質(zhì)干細胞向表皮細胞分化的機制尚不明確,缺乏有效調(diào)控手段。探索有效的骨髓間充質(zhì)干細胞分化調(diào)控藥物,提高骨髓間充質(zhì)干細胞向表皮細胞分化效率,無疑對治療大面積皮

3、膚缺損或是慢性難愈性創(chuàng)面具有重要臨床意義和廣闊應用前景。
　　 法舒地爾,英文名為Fasudil,別名為HA1077,化學名為六氫-1-(5-磺酰基異喹啉)-1(H)-1,4-氮雜,是日本旭化成株式會社和名古屋大學藥理學研究室合作開發(fā)的一種新型異喹啉磺胺衍生物。鹽酸法舒地爾為細胞內(nèi)Ca2+拮抗劑,蛋白激酶抑制劑。其主要用途是用來改善和預防由多種原因引起的腦血管痙攣,選擇性擴張痙攣的腦血管,改善腦缺血癥狀及伴隨的神經(jīng)元損傷。鹽酸法

4、舒地爾為Rho激酶特異性抑制劑,它主要是通過抑制Rho激酶活性而發(fā)揮其藥理作用。Rho蛋白是細胞的轉(zhuǎn)導通路的信號轉(zhuǎn)換器或分子開關(guān),Rho激活的信號傳遞與JNK、P38通路有關(guān),而本實驗室前期研究已證實ERK、p38兩條信號通路與大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞誘導向表皮細胞分化相關(guān)。由此推測,法舒地爾極有可能參與骨髓間充質(zhì)干細胞向表皮細胞分化的調(diào)控?；谝陨险J識,本研究深入探討了骨髓間充質(zhì)干細胞、鹽酸法舒地爾與皮膚創(chuàng)面修復之間的關(guān)系。
　　

5、 目的:
　　 1.探討HA1077阻斷Rho信號對骨髓間充質(zhì)干細胞表達角蛋白的影響。
　　 2.探討HA1077對人骨髓間充質(zhì)干細胞(hMSCs)向表皮細胞表型誘導中細胞周期的影響。
　　 3.觀察HA1077在大鼠皮膚創(chuàng)面愈合中的作用,探討最佳HA1077促愈濃度。
　　 4.觀察HA1077聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細胞在難愈創(chuàng)面治療中的作用
　　 方法:
　　 1.體外原代培養(yǎng)大鼠MSCs,

6、純化、鑒定、傳代擴增。取第3代MSCs,分為正常對照組、單純誘導組、Rho阻斷組,于第1、3、5、7天應用流式細胞儀檢測MSCs定向誘導中磷酸化P38和ERK表達;觀察誘導后第7天各組細胞CK5/8、CK19的陽性表達率;觀察2種濃度(101μmol/L,30μmol/L)HA1077阻斷后,MSCs的CK5/8、CK19陽性表達率。
　　 2.體外原代培養(yǎng)hMSCs,純化、鑒定、傳代擴增。取第3代hMSCs,體外誘導hMSCs

7、向表皮細胞表型分化,分為正常對照組、單純誘導組、Rho阻斷組3組。應用流式細胞儀檢測各組細胞誘導7天后hMSCs細胞周期和增殖細胞核抗原(PCNA)變化。
　　 3.建立大鼠背部皮膚全層缺損模型,分為實驗組和對照組,實驗組分別用10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L、160μmol/L濃度梯度的鹽酸法舒地爾注射液治療大鼠皮膚缺損創(chuàng)面,對照組創(chuàng)面噴灑氯化鈉溶液。觀察各組動物創(chuàng)面愈合情況,并于創(chuàng)傷后第

8、10天取創(chuàng)面組織進行組織學檢查。
　　 4.體外分離培養(yǎng)自體骨髓間充質(zhì)干細胞,純化、鑒定、傳代擴增。臨床病人慢性創(chuàng)面分為對照組、單純HA1077組、HA1077聯(lián)合細胞移植組,觀察各組創(chuàng)面愈合情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.磷酸化P38表達:正常對照組的磷酸化P38為0.02±0.009％;單純誘導組誘導后第5天p38磷酸化水平較對照組增高,差異有統(tǒng)計學意義;Rho阻斷組,磷酸化P38水平在第1天至第7天較對照組

9、和單純誘導組均呈升高,差異有統(tǒng)計學意義。
　　 2.磷酸化ERK表達:正常對照組的磷酸化ERK水平為4.15±0.32％;單純誘導組誘導后第3天至第5天磷酸化ERK表達均呈下降趨勢低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義,第7天時恢復至誘導前水平;Rho阻斷組,ERK磷酸化水平第1天至第5天無明顯變化,第7天時低于對照組和單純誘導組,差異有統(tǒng)計學意義。
　　 3.骨髓間充質(zhì)干細胞角蛋白表達:誘導后第7天,對照組CK5/8陽性率為0.

10、58±0.01％,CK19陽性率為2.04±0.13％;單純誘導組CK5/8為1.81±0.05％,CK19為10.19±0.23％;Rho阻斷1組(10μmol/L);CK5/8為21.65±0.75％,CK19為39.41±0.86％,與單純誘導組相比,升高顯著,P＜0.01;Rho阻斷2組(30μmol/L):CK5/8為21.07±0.57％,CK19為45.60±0.91％,較之單純誘導組升高顯著,P＜0.01;兩種HA107

11、7 Rho阻斷濃度對提高MSCs向表皮細胞分化效率差異不顯著。
　　 4.細胞周期檢測結(jié)果顯示,誘導第7天,對照組、誘導組和Rho阻斷組各組處在G0/G1期的細胞分別為(92.32±0.32)％、(88.76±0.55)％、(79.60±1.99)％,各組間差異有統(tǒng)計學意義;各組處于S期的比例分別為:(8.10±0.54)％、(12.92±0.28)％、(19.22±0.89)％,各組間差異有統(tǒng)計學意義。
　　 5.誘導

12、第7天,對照組、誘導組、HA1077阻斷組PCNA的陽性表達率分別為:(4.28±0.96)％、(8.92±2.23)％、(11.23±0.89)％,其中HA1077阻斷組PCNA的陽性表達率最高,各組間差異有統(tǒng)計學意義。
　　 6.20μmol/L HA1077組創(chuàng)面剩余面積明顯小于同時間點其他各組,除創(chuàng)傷后第7天與80μmol/L組剩余創(chuàng)面面積比較差異無顯著性外,其余各時間點差異均有顯著性(P＜0.05)。
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13、.創(chuàng)面組織學檢查顯示顯示,創(chuàng)傷后第10天,創(chuàng)面肉芽組織明顯增多,應用不同劑量HA1077治療的各組均比對照組肉芽形成明顯,且新生毛細血管豐富,創(chuàng)緣有新生表皮生成;應用20μmol/L HA1077組創(chuàng)面新生肉芽組織生長及新生表皮速度明顯優(yōu)于其他組別。
　　 8.在治療后第7天,對照組、單純HA1077組、HA1077聯(lián)合細胞移植組的創(chuàng)面愈合指數(shù)分別為5.22±5.26、6.86±5.38和9.33±8.23;在治療第14天,各組

14、創(chuàng)面愈合指數(shù)分別為10.29±8.75、13.35±10.57和36.32±9.92,HA1077聯(lián)合細胞移植組創(chuàng)面愈合情況均優(yōu)于單純HA1077組和對照組,差異有統(tǒng)計學意義,而單純應用HA1077組與對照組在各個觀察時相點創(chuàng)面愈合情況差別不大。
　　 結(jié)論:
　　 1.在本實驗誘導條件下,上游信號Rho對p38途徑起反向調(diào)節(jié)。阻斷Rho,可以提高p38的信號磷酸化水平。應用HA1077將上游信號Rho阻斷后可增加p38

15、途徑激活,在一定程度上促進MSCs分化,表達角蛋白CK5/8、CK19陽性率增加。
　　 2.HA1077在體外條件誘導下能促進hMSCs進入S期,PCNA表達增加,使hMSCs增殖能力提高,分化能力增強。PCNA的上調(diào)可能參與了MSCs的向表皮細胞的轉(zhuǎn)分化過程,促進hMSCs向表皮細胞表型的分化。
　　 3.研究表明HA1077可促進皮膚缺損創(chuàng)面愈合;20μmol/L HA1077為最佳創(chuàng)面促愈濃度。
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