HA1077促進骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)皮膚創(chuàng)面的研究.pdf

1、背景:
　　 皮膚是人體面積最大的器官,是機體與外界的機械屏障,具有復(fù)雜的組織結(jié)構(gòu)和多重生理功能。創(chuàng)(燒)傷后皮膚缺損或是糖尿病等慢性病所致頑固性皮膚潰瘍是臨床常見病癥之一,及時有效的創(chuàng)面修復(fù)是此類患者救治的基礎(chǔ)和核心問題。隨著組織工程學(xué)的拓展,應(yīng)用干細(xì)胞技術(shù)有望為創(chuàng)面修復(fù)提供新的手段。近年來,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在創(chuàng)傷修復(fù)方面的作用日益受到各國學(xué)者的廣泛關(guān)注。
　　 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有高度自我更新能力以及多向分化潛能,多

2、項體內(nèi)外研究已證實其可以分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等多種組織細(xì)胞。越來越多的學(xué)者傾向認(rèn)同,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠跨胚層分化為表皮細(xì)胞參與創(chuàng)面修復(fù)。然而,目前研究主要集中在骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的分化結(jié)果上,對于分化中的信號調(diào)控機制研究甚少,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向表皮細(xì)胞分化的機制尚不明確,缺乏有效調(diào)控手段。探索有效的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化調(diào)控藥物,提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向表皮細(xì)胞分化效率,無疑對治療大面積皮

3、膚缺損或是慢性難愈性創(chuàng)面具有重要臨床意義和廣闊應(yīng)用前景。
　　 法舒地爾,英文名為Fasudil,別名為HA1077,化學(xué)名為六氫-1-(5-磺酰基異喹啉)-1(H)-1,4-氮雜,是日本旭化成株式會社和名古屋大學(xué)藥理學(xué)研究室合作開發(fā)的一種新型異喹啉磺胺衍生物。鹽酸法舒地爾為細(xì)胞內(nèi)Ca2+拮抗劑,蛋白激酶抑制劑。其主要用途是用來改善和預(yù)防由多種原因引起的腦血管痙攣,選擇性擴張痙攣的腦血管,改善腦缺血癥狀及伴隨的神經(jīng)元損傷。鹽酸法

4、舒地爾為Rho激酶特異性抑制劑,它主要是通過抑制Rho激酶活性而發(fā)揮其藥理作用。Rho蛋白是細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的信號轉(zhuǎn)換器或分子開關(guān),Rho激活的信號傳遞與JNK、P38通路有關(guān),而本實驗室前期研究已證實ERK、p38兩條信號通路與大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)向表皮細(xì)胞分化相關(guān)。由此推測,法舒地爾極有可能參與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向表皮細(xì)胞分化的調(diào)控?；谝陨险J(rèn)識,本研究深入探討了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、鹽酸法舒地爾與皮膚創(chuàng)面修復(fù)之間的關(guān)系。
　　

5、 目的:
　　 1.探討HA1077阻斷Rho信號對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達角蛋白的影響。
　　 2.探討HA1077對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)向表皮細(xì)胞表型誘導(dǎo)中細(xì)胞周期的影響。
　　 3.觀察HA1077在大鼠皮膚創(chuàng)面愈合中的作用,探討最佳HA1077促愈濃度。
　　 4.觀察HA1077聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在難愈創(chuàng)面治療中的作用
　　 方法:
　　 1.體外原代培養(yǎng)大鼠MSCs,

6、純化、鑒定、傳代擴增。取第3代MSCs,分為正常對照組、單純誘導(dǎo)組、Rho阻斷組,于第1、3、5、7天應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測MSCs定向誘導(dǎo)中磷酸化P38和ERK表達;觀察誘導(dǎo)后第7天各組細(xì)胞CK5/8、CK19的陽性表達率;觀察2種濃度(101μmol/L,30μmol/L)HA1077阻斷后,MSCs的CK5/8、CK19陽性表達率。
　　 2.體外原代培養(yǎng)hMSCs,純化、鑒定、傳代擴增。取第3代hMSCs,體外誘導(dǎo)hMSCs

7、向表皮細(xì)胞表型分化,分為正常對照組、單純誘導(dǎo)組、Rho阻斷組3組。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞誘導(dǎo)7天后hMSCs細(xì)胞周期和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)變化。
　　 3.建立大鼠背部皮膚全層缺損模型,分為實驗組和對照組,實驗組分別用10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L、160μmol/L濃度梯度的鹽酸法舒地爾注射液治療大鼠皮膚缺損創(chuàng)面,對照組創(chuàng)面噴灑氯化鈉溶液。觀察各組動物創(chuàng)面愈合情況,并于創(chuàng)傷后第

8、10天取創(chuàng)面組織進行組織學(xué)檢查。
　　 4.體外分離培養(yǎng)自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,純化、鑒定、傳代擴增。臨床病人慢性創(chuàng)面分為對照組、單純HA1077組、HA1077聯(lián)合細(xì)胞移植組,觀察各組創(chuàng)面愈合情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.磷酸化P38表達:正常對照組的磷酸化P38為0.02±0.009％;單純誘導(dǎo)組誘導(dǎo)后第5天p38磷酸化水平較對照組增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;Rho阻斷組,磷酸化P38水平在第1天至第7天較對照組

9、和單純誘導(dǎo)組均呈升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 2.磷酸化ERK表達:正常對照組的磷酸化ERK水平為4.15±0.32％;單純誘導(dǎo)組誘導(dǎo)后第3天至第5天磷酸化ERK表達均呈下降趨勢低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,第7天時恢復(fù)至誘導(dǎo)前水平;Rho阻斷組,ERK磷酸化水平第1天至第5天無明顯變化,第7天時低于對照組和單純誘導(dǎo)組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 3.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞角蛋白表達:誘導(dǎo)后第7天,對照組CK5/8陽性率為0.

10、58±0.01％,CK19陽性率為2.04±0.13％;單純誘導(dǎo)組CK5/8為1.81±0.05％,CK19為10.19±0.23％;Rho阻斷1組(10μmol/L);CK5/8為21.65±0.75％,CK19為39.41±0.86％,與單純誘導(dǎo)組相比,升高顯著,P＜0.01;Rho阻斷2組(30μmol/L):CK5/8為21.07±0.57％,CK19為45.60±0.91％,較之單純誘導(dǎo)組升高顯著,P＜0.01;兩種HA107

11、7 Rho阻斷濃度對提高MSCs向表皮細(xì)胞分化效率差異不顯著。
　　 4.細(xì)胞周期檢測結(jié)果顯示,誘導(dǎo)第7天,對照組、誘導(dǎo)組和Rho阻斷組各組處在G0/G1期的細(xì)胞分別為(92.32±0.32)％、(88.76±0.55)％、(79.60±1.99)％,各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義;各組處于S期的比例分別為:(8.10±0.54)％、(12.92±0.28)％、(19.22±0.89)％,各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 5.誘導(dǎo)

12、第7天,對照組、誘導(dǎo)組、HA1077阻斷組PCNA的陽性表達率分別為:(4.28±0.96)％、(8.92±2.23)％、(11.23±0.89)％,其中HA1077阻斷組PCNA的陽性表達率最高,各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 6.20μmol/L HA1077組創(chuàng)面剩余面積明顯小于同時間點其他各組,除創(chuàng)傷后第7天與80μmol/L組剩余創(chuàng)面面積比較差異無顯著性外,其余各時間點差異均有顯著性(P＜0.05)。
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13、.創(chuàng)面組織學(xué)檢查顯示顯示,創(chuàng)傷后第10天,創(chuàng)面肉芽組織明顯增多,應(yīng)用不同劑量HA1077治療的各組均比對照組肉芽形成明顯,且新生毛細(xì)血管豐富,創(chuàng)緣有新生表皮生成;應(yīng)用20μmol/L HA1077組創(chuàng)面新生肉芽組織生長及新生表皮速度明顯優(yōu)于其他組別。
　　 8.在治療后第7天,對照組、單純HA1077組、HA1077聯(lián)合細(xì)胞移植組的創(chuàng)面愈合指數(shù)分別為5.22±5.26、6.86±5.38和9.33±8.23;在治療第14天,各組

14、創(chuàng)面愈合指數(shù)分別為10.29±8.75、13.35±10.57和36.32±9.92,HA1077聯(lián)合細(xì)胞移植組創(chuàng)面愈合情況均優(yōu)于單純HA1077組和對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,而單純應(yīng)用HA1077組與對照組在各個觀察時相點創(chuàng)面愈合情況差別不大。
　　 結(jié)論:
　　 1.在本實驗誘導(dǎo)條件下,上游信號Rho對p38途徑起反向調(diào)節(jié)。阻斷Rho,可以提高p38的信號磷酸化水平。應(yīng)用HA1077將上游信號Rho阻斷后可增加p38

15、途徑激活,在一定程度上促進MSCs分化,表達角蛋白CK5/8、CK19陽性率增加。
　　 2.HA1077在體外條件誘導(dǎo)下能促進hMSCs進入S期,PCNA表達增加,使hMSCs增殖能力提高,分化能力增強。PCNA的上調(diào)可能參與了MSCs的向表皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化過程,促進hMSCs向表皮細(xì)胞表型的分化。
　　 3.研究表明HA1077可促進皮膚缺損創(chuàng)面愈合;20μmol/L HA1077為最佳創(chuàng)面促愈濃度。
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