HA1077促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)皮膚創(chuàng)面的研究.pdf

1、背景:
　　 皮膚是人體面積最大的器官,是機(jī)體與外界的機(jī)械屏障,具有復(fù)雜的組織結(jié)構(gòu)和多重生理功能。創(chuàng)(燒)傷后皮膚缺損或是糖尿病等慢性病所致頑固性皮膚潰瘍是臨床常見(jiàn)病癥之一,及時(shí)有效的創(chuàng)面修復(fù)是此類(lèi)患者救治的基礎(chǔ)和核心問(wèn)題。隨著組織工程學(xué)的拓展,應(yīng)用干細(xì)胞技術(shù)有望為創(chuàng)面修復(fù)提供新的手段。近年來(lái),骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在創(chuàng)傷修復(fù)方面的作用日益受到各國(guó)學(xué)者的廣泛關(guān)注。
　　 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有高度自我更新能力以及多向分化潛能,多

2、項(xiàng)體內(nèi)外研究已證實(shí)其可以分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等多種組織細(xì)胞。越來(lái)越多的學(xué)者傾向認(rèn)同,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠跨胚層分化為表皮細(xì)胞參與創(chuàng)面修復(fù)。然而,目前研究主要集中在骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的分化結(jié)果上,對(duì)于分化中的信號(hào)調(diào)控機(jī)制研究甚少,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向表皮細(xì)胞分化的機(jī)制尚不明確,缺乏有效調(diào)控手段。探索有效的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化調(diào)控藥物,提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向表皮細(xì)胞分化效率,無(wú)疑對(duì)治療大面積皮

3、膚缺損或是慢性難愈性創(chuàng)面具有重要臨床意義和廣闊應(yīng)用前景。
　　 法舒地爾,英文名為Fasudil,別名為HA1077,化學(xué)名為六氫-1-(5-磺?；愢?-1(H)-1,4-氮雜,是日本旭化成株式會(huì)社和名古屋大學(xué)藥理學(xué)研究室合作開(kāi)發(fā)的一種新型異喹啉磺胺衍生物。鹽酸法舒地爾為細(xì)胞內(nèi)Ca2+拮抗劑,蛋白激酶抑制劑。其主要用途是用來(lái)改善和預(yù)防由多種原因引起的腦血管痙攣,選擇性擴(kuò)張痙攣的腦血管,改善腦缺血癥狀及伴隨的神經(jīng)元損傷。鹽酸法

4、舒地爾為Rho激酶特異性抑制劑,它主要是通過(guò)抑制Rho激酶活性而發(fā)揮其藥理作用。Rho蛋白是細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的信號(hào)轉(zhuǎn)換器或分子開(kāi)關(guān),Rho激活的信號(hào)傳遞與JNK、P38通路有關(guān),而本實(shí)驗(yàn)室前期研究已證實(shí)ERK、p38兩條信號(hào)通路與大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)向表皮細(xì)胞分化相關(guān)。由此推測(cè),法舒地爾極有可能參與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向表皮細(xì)胞分化的調(diào)控?；谝陨险J(rèn)識(shí),本研究深入探討了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、鹽酸法舒地爾與皮膚創(chuàng)面修復(fù)之間的關(guān)系。
　　

5、 目的:
　　 1.探討HA1077阻斷Rho信號(hào)對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)角蛋白的影響。
　　 2.探討HA1077對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)向表皮細(xì)胞表型誘導(dǎo)中細(xì)胞周期的影響。
　　 3.觀察HA1077在大鼠皮膚創(chuàng)面愈合中的作用,探討最佳HA1077促愈濃度。
　　 4.觀察HA1077聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在難愈創(chuàng)面治療中的作用
　　 方法:
　　 1.體外原代培養(yǎng)大鼠MSCs,

6、純化、鑒定、傳代擴(kuò)增。取第3代MSCs,分為正常對(duì)照組、單純誘導(dǎo)組、Rho阻斷組,于第1、3、5、7天應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)MSCs定向誘導(dǎo)中磷酸化P38和ERK表達(dá);觀察誘導(dǎo)后第7天各組細(xì)胞CK5/8、CK19的陽(yáng)性表達(dá)率;觀察2種濃度(101μmol/L,30μmol/L)HA1077阻斷后,MSCs的CK5/8、CK19陽(yáng)性表達(dá)率。
　　 2.體外原代培養(yǎng)hMSCs,純化、鑒定、傳代擴(kuò)增。取第3代hMSCs,體外誘導(dǎo)hMSCs

7、向表皮細(xì)胞表型分化,分為正常對(duì)照組、單純誘導(dǎo)組、Rho阻斷組3組。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞誘導(dǎo)7天后hMSCs細(xì)胞周期和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)變化。
　　 3.建立大鼠背部皮膚全層缺損模型,分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組分別用10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L、160μmol/L濃度梯度的鹽酸法舒地爾注射液治療大鼠皮膚缺損創(chuàng)面,對(duì)照組創(chuàng)面噴灑氯化鈉溶液。觀察各組動(dòng)物創(chuàng)面愈合情況,并于創(chuàng)傷后第

8、10天取創(chuàng)面組織進(jìn)行組織學(xué)檢查。
　　 4.體外分離培養(yǎng)自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,純化、鑒定、傳代擴(kuò)增。臨床病人慢性創(chuàng)面分為對(duì)照組、單純HA1077組、HA1077聯(lián)合細(xì)胞移植組,觀察各組創(chuàng)面愈合情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.磷酸化P38表達(dá):正常對(duì)照組的磷酸化P38為0.02±0.009％;單純誘導(dǎo)組誘導(dǎo)后第5天p38磷酸化水平較對(duì)照組增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;Rho阻斷組,磷酸化P38水平在第1天至第7天較對(duì)照組

9、和單純誘導(dǎo)組均呈升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2.磷酸化ERK表達(dá):正常對(duì)照組的磷酸化ERK水平為4.15±0.32％;單純誘導(dǎo)組誘導(dǎo)后第3天至第5天磷酸化ERK表達(dá)均呈下降趨勢(shì)低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,第7天時(shí)恢復(fù)至誘導(dǎo)前水平;Rho阻斷組,ERK磷酸化水平第1天至第5天無(wú)明顯變化,第7天時(shí)低于對(duì)照組和單純誘導(dǎo)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞角蛋白表達(dá):誘導(dǎo)后第7天,對(duì)照組CK5/8陽(yáng)性率為0.

10、58±0.01％,CK19陽(yáng)性率為2.04±0.13％;單純誘導(dǎo)組CK5/8為1.81±0.05％,CK19為10.19±0.23％;Rho阻斷1組(10μmol/L);CK5/8為21.65±0.75％,CK19為39.41±0.86％,與單純誘導(dǎo)組相比,升高顯著,P＜0.01;Rho阻斷2組(30μmol/L):CK5/8為21.07±0.57％,CK19為45.60±0.91％,較之單純誘導(dǎo)組升高顯著,P＜0.01;兩種HA107

11、7 Rho阻斷濃度對(duì)提高M(jìn)SCs向表皮細(xì)胞分化效率差異不顯著。
　　 4.細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示,誘導(dǎo)第7天,對(duì)照組、誘導(dǎo)組和Rho阻斷組各組處在G0/G1期的細(xì)胞分別為(92.32±0.32)％、(88.76±0.55)％、(79.60±1.99)％,各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;各組處于S期的比例分別為:(8.10±0.54)％、(12.92±0.28)％、(19.22±0.89)％,各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 5.誘導(dǎo)

12、第7天,對(duì)照組、誘導(dǎo)組、HA1077阻斷組PCNA的陽(yáng)性表達(dá)率分別為:(4.28±0.96)％、(8.92±2.23)％、(11.23±0.89)％,其中HA1077阻斷組PCNA的陽(yáng)性表達(dá)率最高,各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 6.20μmol/L HA1077組創(chuàng)面剩余面積明顯小于同時(shí)間點(diǎn)其他各組,除創(chuàng)傷后第7天與80μmol/L組剩余創(chuàng)面面積比較差異無(wú)顯著性外,其余各時(shí)間點(diǎn)差異均有顯著性(P＜0.05)。
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13、.創(chuàng)面組織學(xué)檢查顯示顯示,創(chuàng)傷后第10天,創(chuàng)面肉芽組織明顯增多,應(yīng)用不同劑量HA1077治療的各組均比對(duì)照組肉芽形成明顯,且新生毛細(xì)血管豐富,創(chuàng)緣有新生表皮生成;應(yīng)用20μmol/L HA1077組創(chuàng)面新生肉芽組織生長(zhǎng)及新生表皮速度明顯優(yōu)于其他組別。
　　 8.在治療后第7天,對(duì)照組、單純HA1077組、HA1077聯(lián)合細(xì)胞移植組的創(chuàng)面愈合指數(shù)分別為5.22±5.26、6.86±5.38和9.33±8.23;在治療第14天,各組

14、創(chuàng)面愈合指數(shù)分別為10.29±8.75、13.35±10.57和36.32±9.92,HA1077聯(lián)合細(xì)胞移植組創(chuàng)面愈合情況均優(yōu)于單純HA1077組和對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而單純應(yīng)用HA1077組與對(duì)照組在各個(gè)觀察時(shí)相點(diǎn)創(chuàng)面愈合情況差別不大。
　　 結(jié)論:
　　 1.在本實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)條件下,上游信號(hào)Rho對(duì)p38途徑起反向調(diào)節(jié)。阻斷Rho,可以提高p38的信號(hào)磷酸化水平。應(yīng)用HA1077將上游信號(hào)Rho阻斷后可增加p38

15、途徑激活,在一定程度上促進(jìn)MSCs分化,表達(dá)角蛋白CK5/8、CK19陽(yáng)性率增加。
　　 2.HA1077在體外條件誘導(dǎo)下能促進(jìn)hMSCs進(jìn)入S期,PCNA表達(dá)增加,使hMSCs增殖能力提高,分化能力增強(qiáng)。PCNA的上調(diào)可能參與了MSCs的向表皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化過(guò)程,促進(jìn)hMSCs向表皮細(xì)胞表型的分化。
　　 3.研究表明HA1077可促進(jìn)皮膚缺損創(chuàng)面愈合;20μmol/L HA1077為最佳創(chuàng)面促愈濃度。
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