Vitamin K2抑制HSD17B4促肝癌細胞增殖的機制研究.pdf

1、目的：肝細胞癌是全球第三大致死性癌癥，其發(fā)病率高，預(yù)后較差，目前仍缺乏有效的治療效果。尋找有效的肝細胞癌治療和輔助治療藥物有重要的意義。17β-羥類固醇脫氫酶（17β-Hydroxysteroid dehydrogenase, HSD17B4）催化雌二醇（E2）脫氫失活，生成雌酮（E1），是一種重要的激素代謝酶。我們近期的研究發(fā)現(xiàn)，人肝癌組織中HSD17B4高表達，肝癌細胞HepG2中高表達的HSD17B4降低E2水平后，使信號途徑中的

2、蛋白激酶（Akt）和絲裂原信號調(diào)節(jié)激酶MEK/ERK激活，進而使STAT3磷酸化激活，上調(diào)cyclin D1和PCNA等基因的表達，最終促進肝癌細胞的增殖。維生素K(VK)是一種脂溶性維生素。VK除了凝血作用外，還有抗包括肝癌在內(nèi)的多種腫瘤的作用。VK2的類似物，對肝癌的發(fā)展有一定的抑制作用，對介入和手術(shù)治療后的復(fù)發(fā)也有較好的療效。最近的，一篇報道顯示， VK2可與HepG2細胞內(nèi)的HSD17B4相結(jié)合而影響其活性。綜合以上我們的前期工

3、作以及文獻報道的實驗結(jié)果，我們的考慮：VK2是否也可能通過與HSD17B4相互作用，降低其活性，上調(diào)雌激素（E2）水平，來發(fā)揮其抑制肝癌細胞的增殖的作用？為了驗證上述假設(shè)，本實驗用VK2處理 HSD17B4過表達的HepG2細胞后，觀察其在裸鼠皮下成瘤的瘤體大??；觀察VK2處理HepG2后，細胞的增殖、激素水平變化、VK2與HSD17B4的相互作用，以及其相關(guān)信號通路關(guān)鍵分子的活性改變，探討VK2對HSD17B4過表達引起的肝癌細胞增殖

4、的抑制作用，為VK2作為預(yù)防和治療肝癌的輔助分子提供理論和實驗依據(jù)。
　　方法：①常規(guī)培養(yǎng)人類肝癌細胞株HepG2細胞。②給HepG2細胞轉(zhuǎn)染過表達HSD17B4的表達質(zhì)粒和對照的空質(zhì)粒并給予 VK2處理；或HepG2細胞轉(zhuǎn)入敲低HSD17B4的siRNA和對照的siRNA，并給予VK2處理。③在裸鼠皮下注射上述過表達或敲低HSD17B4并VK2處理后的HepG2細胞，成瘤6周，觀察瘤體大小。④檢測VK2對HSD17B4引起的HC

5、C細胞增殖的抑制作用。⑤實時定量PCR檢測VK2對HSD17B4轉(zhuǎn)錄水平的影響。⑥Western blot測定VK2對HSD17B4、cyclin D1、PCNA、p-STAT3、p-Akt、p-MEK和p-ERK的蛋白水平表達的影響。⑦用相同時間內(nèi)底物 E2的減少量反映 HSD17B4的催化活性。觀察VK2對HSD17B4的活性影響。⑧用抗體沉淀HSD17B4蛋白，測定沉淀中的VK2量，以證明VK2是否與HSD17B4相互作用。⑨采用

6、SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行處理分析。數(shù)據(jù)以x±SD表示，多組樣本之間兩兩比較用多個均數(shù)比較的方差分析，以p<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：⑴與Empty(1311±108.6)相比，HSD17B4(7295±1135)組的瘤體較大；兩組分別給予 VK2處理后（ Empty+VK2(421.2±112.7)組/HSD17B4+VK2(2835±682.8)組)，瘤體分別較 VK2未處理組的小。VK2對對照組和 HSD1

7、7B4過表達組的瘤體生長抑制率相同，約為65％。表明，VK2有抑制HSD17B4促裸鼠肝腫瘤生長的作用。⑵與對照組相比，HSD17B4過表達組的HepG2細胞增殖上調(diào)，當分別給予VK2處理后，細胞的增殖呈時間和濃度依賴性地降低；用siRNA敲低了HSD17B4的表達后，細胞的增殖明顯降低，此時，VK2的處理對細胞的增殖影響不大。表明，VK2能抑制HSD17B4促肝癌細胞的增殖。⑶用不同濃度的 VK2（0,20,50,100μmol/L）

8、處理對照組和過表達HSD17B4組的HepG2細胞48 h后，檢測培養(yǎng)基中E2的水平。結(jié)果顯示，隨著VK2劑量的增加，培養(yǎng)基中E2水平也隨之增加。表明，VK2抑制了HepG2細胞的HSD17B4的活性。⑷用VK2分別處理對照組和過表達HSD17B4組的HepG2細胞后，細胞 HSD17B4的 mRNA表達和蛋白水平均無明顯變化。同樣，VK2對HSD17B4敲低(SiHSD17B4組)和其對照組（SiNC組)的HepG2細胞的處理，也不影

9、響細胞的HSD17B4 mRNA水平以及蛋白水平。表明，VK2不是通過抑制HSD17B4的mRNA和蛋白表達而抑制其活性的。⑸給予對照組（Empty)和過表達HSD17B4組的HepG2細胞不同濃度的VK2（0,10,20,50,100μmol/L）處理48 h，用抗HSD17B4抗體沉淀細胞的HSD17B4，用ELISA法檢測沉淀中VK2的含量，以證明VK2是否與HSD17B4結(jié)合。ELISA結(jié)果顯示，隨著VK2劑量的增加，Empty

10、組的沉淀中VK2含量不隨VK2的處理濃度變化而變化，但HSD17B4過表達組的沉淀中VK2含量隨VK2的濃度增加。表明，VK2可與HSD17B4相互作用。⑹Western blot的結(jié)果顯示，給予對照組（Empty)和過表達 HSD17B4組HepG2細胞VK2（50μmol/L）處理48 h后，細胞增殖相關(guān)基因cyclin D1和 PCNA的蛋白水平均有所降低。而 VK2對敲低 HSD17B4(SiHSD17B4)組和其對照組（SiN

11、C)的cyclin D1和PCNA蛋白水平幾乎無影響。表明，VK2能抑制了HSD17B4上調(diào)的細胞增殖相關(guān)基因的蛋白表達。⑺Western blot的結(jié)果顯示，用 VK2（50μmol/L）處理過表達和敲低HSD17B4的HepG2細胞48 h后， VK2顯著降低了過表達HSD17B4組細胞的STAT3的磷酸化水平；而對敲低HSD17B4組細胞的STAT3的磷酸化水平影響不大。表明，VK2能夠抑制HSD17B4上調(diào)的 STAT3的活化。

12、⑻由于 Akt, ERK， MEK激酶信號途徑都與增殖相關(guān)，并能夠激活STAT3，因此，我們用VK2處理過表達和敲低HSD17B4的HepG2細胞后，檢測了這些激酶的活化程度，以證明它們是否與上述的 STAT3的激活抑制有關(guān)。Western blot的結(jié)果顯示，VK2顯著降低了HSD17B4過表達組細胞的Akt， ERK，MEK的磷酸化水平，而對敲低HSD17B4組細胞的 Akt， ERK，MEK的磷酸化水平影響不大。表明，VK2能夠抑