守宮硫酸糖肽抑制肝癌細胞增殖與遷移的體外研究.pdf

1、目的：
　　臨床上，多數(shù)實體惡性腫瘤的硬度高于正常組織，軟堅散結(jié)是中醫(yī)治療惡性腫瘤的重要方法之一。守宮硫酸糖肽是傳統(tǒng)軟堅散結(jié)中藥守宮抗腫瘤的主要有效成份。本課題通過守宮硫酸糖肽對肝癌HepG2細胞的體外研究，探究守宮硫酸糖肽對肝癌HepG2細胞增殖與遷移的影響并初步探討其中的機制。
　　方法：
　　1.取肝癌HepG2細胞，實驗設(shè)置空白對照組、GSPP低劑量組（20μg/mL）、GSPP中劑量組（100μg/mL）、G

2、SPP高劑量組（200μg/mL）。運用MTS試驗觀察守宮硫酸糖肽對肝癌HepG2細胞增殖的影響，并依據(jù)不同觀察時間點的細胞數(shù)繪制細胞生長曲線。
　　2.取肝癌HepG2細胞，實驗分組同上，通過劃痕實驗和Transwell實驗觀察守宮硫酸糖肽對 HepG2細胞遷移的影響。并通過免疫熒光法觀察不同實驗組HepG2細胞內(nèi)E-鈣粘蛋白，Vimentin以及α-SMA表達情況。
　　3.取肝癌HepG2細胞，實驗分組同上，通過流式細

3、胞術(shù)檢測HepG2細胞表面整合素β1表達情況，并通過Western-blot實驗檢測細胞內(nèi)E-鈣粘蛋白及p-ERK表達情況。同時，運用RT-PCR實驗檢測細胞內(nèi)整合素信號通路上Rho，Rac， cdc42，Arp3蛋白的表達情況。
　　結(jié)果：
　　1.MTS法探究守宮硫酸糖肽對HepG2細胞增殖的影響：分別于加藥12h，24h，36h，48h測量每組細胞的OD值。結(jié)果顯示：GSPP高中低劑量組HepG2增殖的細胞數(shù)較空白對照

4、組均明顯較少(P<0.05)，并且高劑量（200μg/mL）組對于增殖的抑制作用最強。
　　2.(1)劃痕實驗：在加入藥物時和加入藥物12小時后，分別測量不同組別細胞遷移運動的距離。通過觀察圖片和測量細胞遷移的距離我們可以看出，三個劑量守宮硫酸糖肽組 HepG2細胞的遷移距離與空白對照組比較，均明顯減少(P<0.01)。
　　(2)Transwell實驗：從穿過Transwell小室膜的細胞數(shù)看，GSPP三個劑量組較空白對照

5、組細胞數(shù)均明顯減少（P<0.01）。并且這種抑制遷移的作用呈劑量依賴性。
　　(3)免疫熒光實驗觀察細胞內(nèi)E-鈣粘蛋白，Vimentin與α-SMA的表達情況：守宮硫酸糖肽三個劑量組與對照組比較，HepG2細胞內(nèi)E-鈣粘蛋白表達增加， Vimentin與α-SMA表達減少。
　　3.(1)流式細胞術(shù)檢測HepG2細胞表面整合素β1蛋白的表達：與空白對照組比較，加入守宮硫酸糖肽的三個劑量組整合素β1的表達均明顯減少（P<0.0

6、5）。
　　(2)通過Western-blot實驗觀察HepG2細胞內(nèi)p-ERK與E-鈣粘蛋白的表達情況：守宮硫酸糖肽三個不同劑量組p-ERK蛋白的表達量均明顯低于空白對照組，而E-鈣粘蛋白的表達量則高于對照組。
　　(3)RT-PCR檢測HepG2細胞內(nèi)整合素信號通路上蛋白的表達：加藥組HepG2細胞內(nèi)整合素通路上的 Rho，Rac，cdc42，Arp3蛋白表達量均較空白對照組均明顯減少（P<0.05）。
　　結(jié)論：