Hsa-let-7g抑制肝癌細胞增殖的分子機制研究和斑馬魚肝癌研究模型的建立.pdf

1、原發(fā)性肝細胞肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，約占原發(fā)性肝癌的百分之九十。其發(fā)病隱匿、早期診斷困難、易復發(fā)、預后差、死亡率高。MircoRNA是一類存在于真核生物中長約22 nt的非編碼、具調控功能的單鏈小分子RNA，參與生命過程中一系列重要的進程，包括個體發(fā)育、器官形成、細胞增殖與死亡、神經細胞和干細胞等細胞的分化、造血生成、脂肪等物質代謝、激素分泌、腫瘤形成等生物學過程。近期研究發(fā)現，miRNA在不同肝癌細胞株和不同國家或不同地區(qū)的肝

2、癌組織中異常表達，表明miRNA可能參與了肝細胞癌變的過程。已證實的miRNA在HCC中的靶基因包括參與蛋白質合成與水解、細胞周期、細胞增殖、分化與凋亡、信號傳導與轉錄、物質代謝等生物生命進程中的多個基因，涉及到腫瘤發(fā)生發(fā)展的很多方面。因此，對HCC相關的miRNA進行深入研究是非常有必要的。
　　 由于原發(fā)性肝細胞肝癌已成為危害人類生命健康的主要腫瘤之一，多年來人們一直在探索治療原發(fā)性肝癌的新方法，不斷研制新藥物。因此，建立體

3、內動物模型研究HCC的發(fā)生發(fā)展及篩選治療HCC的藥物不僅是十分必要的，而且需要不斷探索更好更有效的體內肝癌研究模型。斑馬魚是近年來興起的體內動物研究模型，自然界中斑馬魚組織器官的癌變與人類極為相似，這為斑馬魚在體內研究人類腫瘤發(fā)展提供了很好的基礎。由于斑馬魚腫瘤模型相對于大小鼠腫瘤模型擁有很多優(yōu)點：易于飼養(yǎng)，經濟方便，產卵量高；并且胚胎透明，易于觀察癌細胞擴散、轉移、滲透和血管生成；在藥物篩選方面，斑馬魚可以有效的吸收周圍水環(huán)境中的小分

4、子化合物，使抗癌藥物的大規(guī)模篩選簡便易行。
　　 本研究意在探討miRNA中的一個重要家族，let-7家族成員：hsa-let-7g在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用。進而研究hsa-let-7g在肝癌中的具體生物學功能，為miRNA在臨床診斷、治療、預后評估及應用于臨床的肝癌治療奠定理論基礎。本研究同時建立了斑馬魚肝癌體內研究模型，為在體內研究miRNA及肝癌的發(fā)生發(fā)展和篩選抗肝癌藥物建立新的體內研究模型奠定實驗基礎。
　　 主要

5、研究內容和結果如下：
　　 第一章、Hsa-let-7g在肝癌細胞中的表達特征
　　 經qPCR方法檢測發(fā)現，與人正常肝細胞LO2相比，hsa-let-7g在人肝癌細胞HepG2，、Hep3B和Huh7中呈明顯低表達狀態(tài)，而在Bel-7404細胞株中表現為高表達。
　　 第二章、Hsa-let-7g靶基因的預測及作用位點檢測
　　 1.Hsa-let-7g靶基因的預測
　　 經過查找Ensembl

6、e Genome Brower database，發(fā)現hsa-let-7g基因以反義鏈的形式存在于第3號染色體。為研究hsa-let-7g在人肝癌細胞中的功能，我們對hsa-let-7g的靶基因進行了預測。發(fā)現原癌基因c-Myc mRNA的3'UTR區(qū)域一第138-147位堿基與hsa-let-7g的seed區(qū)域有很好的匹配，并且該seed區(qū)域在人、牛、豬、大鼠、小鼠及非洲爪蟾6個物種中高度保守。經過在Ensemble Genome B

7、rower database中序列比對分析，hsa-let-7g的成熟序列及其前體序列在24個物種中高度保守。
　　 2.Hsa-let-7g作用位點檢測
　　 綜合預測的結果，我們將與hsa-let-7g的seed區(qū)域相結合的c-Myc3'UTR作用位點及作用位點堿基突變的片段克隆到psiCHECK2質粒上，構建了含hsa-let-7g作用位點的c-Myc3'UTR熒光素酶報告系統載體，并同時構建了其作用位點突變的載體

8、作為陰性對照。有研究表明，hsa-let-7g可以與N-Ras基因mRNA的3'UTR相結合，調控N-Ras基因的轉錄后翻譯。因此，我們將與hsa-let-7g相結合的N-ras3'UTR作用位點克隆到psiCHECK2質粒，構建含hsa-let-7g作用位點的N-ras3'UTR熒光素酶報告系統載體作為陽性對照。將克隆好的含有與hsa-let-7g相互作用位點的c-Myc3'UTR載體，、c-Myc-3'UTR作用位點突變載體和N-R

9、as3'UTR載體與hsa-let-7g或mimicsnegative control共轉染HepG2肝癌細胞，檢測熒光素酶的活性。結果顯示：只有共轉染c-Myc3'UTR+hsa-let-7g和N-Ras3'UTR+hsa-let-7g兩組的熒光素酶活性顯著下降而其他陰性對照組沒有顯著性差異，從而用生物學實驗的方法證明了hsa-let-7g的seed區(qū)域與c-Myc3'UTR的第138-147位堿基相結合，即c-Myc是hsa-let

10、-7g的靶基因。
　　 第三章、Hsa-let-7g對肝癌細胞增殖作用機制的研究
　　 1.Hsa-let-7g抑制肝癌細胞的增殖
　　 根據hsa-let-7g在人肝癌中的表達模式，我們選取HepG2和Bel-7404細胞株來探討hsa-let-7g在肝癌細胞中的生物學功能。由于hsa-let-7g在肝癌細胞HepG2中低表達，我們將hsa-let-7g mimics轉染HepG2細胞，分別于轉染后的Day1、

11、Day2、Day3、Day4、Day5用MTT實驗檢測細胞增殖變化。轉染hsa-let-7gmimics后48 h，與對照組相比較，HepG2細胞中hsa-let-7g的水平明顯升高(p＜0.05)說明成功地轉染hsa-let-7g mimics可以特異明顯的升高肝癌細胞HepG2中hsa-let-7g水平。從轉染后48 h開始，hsa-let-7g mimics可以抑制肝癌HepG2的增殖，其抑制作用持續(xù)至轉染后第5天。而將hsa-l

12、et-7g inhibitor轉染hsa-let-7g高表達的Bel-7404細胞72h，與對照組相比較，Bel-7404細胞中hsa-let-7g的水平明顯降低(p＜0.05)說明成功地轉染hsa-let-7g inhibitor可以特異明顯的降低肝癌細胞Bel-7404中hsa-let-7g水平。hsa-let-7g inhibitor將hsa-let-7g抑制后，可促進Bel-7404的增殖，促進增殖作用從轉染后72h開始，持續(xù)至

13、轉染后第5天。由此結果說明，在不同hsa-let-7g表達的肝癌細胞株中，hsa-let-7g從正反兩個方面均能調節(jié)肝癌細胞的增殖，發(fā)揮其抑制肝癌細胞增殖的作用。
　　 2.Hsa-let-7g下調原癌基因c-Myc的表達
　　 經過預測和實驗證明，原癌基因c-Myc是hsa-let-7g的靶基因。經qPCR檢測，發(fā)現與正常肝細胞LO2相比，肝癌HepG2和Bel-7404細胞中原癌基因c-Myc的mRNA表達明顯升高了

14、至少6倍。
　　 3.Hsa-let-7g對肝癌細胞蛋白質組表達的影響：
　　 為了進一步研究hsa-let-7g對肝癌細胞增殖的具體機制以及其對肝癌細胞蛋白質組表達的影響，我們對轉染了hsa-let-7g mimics和mimics negative control的HepG2細胞進行二維電泳，檢測其蛋白質組表達變化。
　　 4.Hsa-let-7g下調原癌基因Bmi-1的表達：
　　 綜合上述實驗結果

15、，我們發(fā)現hsa-let-7g通過調節(jié)原癌基因c-Myc和抑癌基因p16的表達從而調節(jié)肝癌細胞的增殖。
　　 第四章、斑馬魚肝癌研究模型的構建
　　 為進一步在體內研究hsa-let-7g及其它miRNA的功能，我們以斑馬魚為模式生物，建立了斑馬魚肝癌研究模型。將線性化的pcDNA3.0+DsRed質粒轉染人肝癌細胞HepG2后，將轉染了pcDNA3.0+DsRed紅色熒光質粒的HepG2細胞用顯微注射的方法注射進入發(fā)育

16、了2天的轉基因斑馬魚flk1：GFP幼魚的卵黃內。結果發(fā)現，注射進入幼魚的肝癌細胞能夠從斑馬魚腸下血管誘導血管生成，說明人肝癌細胞在斑馬魚體內存活，并誘導了斑馬魚的血管生成，斑馬魚肝癌體內研究模型構建成功。
　　 結論及研究意義：
　　 1.原癌基因c-Myc是hsa-let-7g的靶基因
　　 經實驗證實，let-7家族成員之一，hsa-let-7g的seed區(qū)域與c-Myc3'UTR的第138-147位堿基相

17、作用，即原癌基因c-Myc是hsa-let-7g的靶基因。
　　 2.Hsa-let-7g通過調節(jié)c-Myc-Bmi-1-p16通路抑制肝癌細胞的增殖
　　 本研究首次發(fā)現：在人肝癌細胞中，hsa-let-7g能夠通過直接下調原癌基因c-Myc、間接下調原癌基因Bmi-1及間接上調抑癌基因p16來抑制肝癌細胞的增殖，即hsa-let-7g參與了肝癌細胞中c-Myc-Bmi-1-p16通路的調節(jié)。
　　 3.成功建