TNF-α在圍生期大鼠肝內(nèi)表達(dá)特征的初步研究.pdf

1、目的:
　　膽道閉鎖(biliary atresia,BA)是引起新生兒阻塞性黃疸最常見(jiàn)的原因之一，其與自發(fā)性新生兒肝炎(INC)共占新生兒膽汁淤積性疾病的50％～70％。膽道閉鎖在亞洲人群中發(fā)病率約為1/8000，在歐洲人群中發(fā)病率約為1/18000，女?huà)氚l(fā)病數(shù)量較多。其特征性病變是患兒在3個(gè)月內(nèi)即出現(xiàn)全部或部分肝外膽管系統(tǒng)進(jìn)行性纖維化閉塞，同時(shí)伴肝內(nèi)膽管損傷及肝纖維化。臨床表現(xiàn)為阻塞性黃疸、白陶土大便、肝脾大三聯(lián)征，同時(shí)實(shí)驗(yàn)室

2、檢查膽紅素及轉(zhuǎn)氨酶升高，且進(jìn)展迅速。
　　膽道閉鎖病因未明，一般認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制涉及病毒感染、自身免疫介導(dǎo)的膽管破壞及膽道發(fā)育異常。20世紀(jì)90年以來(lái)，隨著研究深入，由圍生期病毒感染激發(fā)的免疫炎癥反應(yīng)在BA的發(fā)生中起重要作用，尤其是病毒感染所引發(fā)的進(jìn)行性纖維化病變是膽道閉鎖發(fā)生的重要原因之一。由病毒抗原激活的特異性T細(xì)胞通過(guò)γ干擾素（IFN-γ）刺激巨噬細(xì)胞釋放一氧化氮、氧代謝物質(zhì)和腫瘤壞死因子（TNF），能特異性破壞膽管上皮細(xì)胞，

3、引起細(xì)胞壞死和凋亡，即使病毒被清除，膽管上皮細(xì)胞炎癥和損傷仍持續(xù)存在，并最終導(dǎo)致肝外膽管的纖維化和梗阻。
　　目前已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證明，圍生期的小鼠經(jīng)過(guò)腹腔內(nèi)注射感染輪狀病毒可以形成類(lèi)似于膽道閉鎖的動(dòng)物模型，而在其他時(shí)間內(nèi)感染并不會(huì)造成新生鼠膽汁淤積和膽道閉鎖發(fā)生，這可以說(shuō)明圍生期的免疫系統(tǒng)發(fā)育具有一定的特殊性。
　　本研究擬對(duì)圍生期內(nèi)巨噬細(xì)胞及其分泌的腫瘤壞死因子的表達(dá)情況進(jìn)行分析，進(jìn)一步了解這一特殊時(shí)期小鼠易患膽道閉鎖的

4、機(jī)制。
　　方法:
　　一、標(biāo)本制備
　　Wistar孕鼠取孕17-21天(E17-21)的Wistar大鼠胎鼠及出生0-5天(N0-N5)的新生鼠，取出胎鼠及新生鼠的肝臟，其中E17、E19、N1、N3每組各取5個(gè)標(biāo)本固定于4％多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中，常規(guī)脫水，石蠟包埋，制成蠟塊。其余保存于-80℃冰箱中，用于Western blot及RT-PCR檢測(cè)。
　　二、實(shí)驗(yàn)方法
　　1、Western blot

5、及RT-PCR:冰凍標(biāo)本中提取總蛋白及總RNA，通過(guò)Westernblot及RT-PCR方法檢測(cè)各年齡組腫瘤壞死因子（TNF-α）及巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)記物F4/80在圍生期各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)情況。
　　2、免疫組織化學(xué)方法:石蠟標(biāo)本連續(xù)切片，厚度4μm，應(yīng)用免疫組化方法染色分別檢測(cè)F4/80及TNF-α表達(dá)情況。采用NIS-Elements Basic Research多媒體彩色病理圖像分析系統(tǒng)對(duì)F4/80及TNF-α表達(dá)進(jìn)行觀察，并

6、分析判斷陽(yáng)性細(xì)胞的總體趨勢(shì)。
　　三、數(shù)據(jù)分析
　　所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)值比較采用t檢驗(yàn)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　一、Western blot結(jié)果
　　TNF-α的蛋白量在E17-E20時(shí)水平較高，在出生前逐漸降低，中間略有波動(dòng)，N0-N2時(shí)降至最低，之后又逐漸上升，N5時(shí)升至最高。F4/80的蛋白量變化與TNF-

7、α相似，同樣是出生前逐漸降低，在N0-N2時(shí)降至最低，后又逐漸上升，N5時(shí)達(dá)到最高。
　　二、RT-PCR結(jié)果
　　TNF-α mRNA水平在產(chǎn)前至N0水平相對(duì)較高，出生后迅速降低，N1-N4時(shí)降至最低，之后又逐漸上升。F4/80 mRNA的表達(dá)同樣在出生前逐漸下降，N0-N2時(shí)降至最低，之后又逐漸上升，N5時(shí)升至最高。
　　三、免疫組化染色結(jié)果
　　TNF-α的陽(yáng)性表達(dá)的平均光密度在E19天（0.1724±0.

8、021）及N1天時(shí)（0.1656±0.017）表達(dá)較少，而在E17天（0.1938±0.025）及N3天（0.1952±0.021）時(shí)的陽(yáng)性表達(dá)相對(duì)略多。巨噬細(xì)胞標(biāo)記物F4/80同樣是在E19天（0.1891±0.018）及N1天時(shí)（0.1868±0.020）表達(dá)較少，而在E17天（0.1919±0.024）及N3天（0.1947±0.027）時(shí)的陽(yáng)性表達(dá)相對(duì)略多。P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　TNF-α