5-HT受體基因多態(tài)性與電磁輻射致認(rèn)知功能改變易感性的相關(guān)性研究.pdf

1、目的意義:
　　隨著現(xiàn)代科技應(yīng)用領(lǐng)域的不斷擴(kuò)展，電磁輻射日益成為威脅人類健康的環(huán)境因素。中樞神經(jīng)系統(tǒng)是電磁輻射的敏感靶器官之一，但電磁輻射對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響及機(jī)制研究目前尚無統(tǒng)一定論。5-HT系統(tǒng)在大腦發(fā)育、認(rèn)知功能及情緒調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，基因多態(tài)性是導(dǎo)致不同個(gè)體間生物性狀差異的遺傳學(xué)基礎(chǔ)，5-HT受體基因多態(tài)性是否在電磁輻射生物效應(yīng)的易感性中發(fā)揮作用尚不明確。本研究從認(rèn)知功能著手，以SNP為遺傳標(biāo)記，著眼于5-HT1A/2

2、A/2CR基因，展開5-HT受體基因多態(tài)性與電磁輻射致認(rèn)知功能改變易感性的相關(guān)性研究，以期篩選出對電磁輻射易感的相關(guān)基因SNP位點(diǎn)，為電磁暴露人群早期的防診治和職業(yè)電磁操作人員的遴選提供候選指標(biāo)。
　　材料方法:
　　(1)輻射方法:2.856 GHz微波輻射，在體實(shí)驗(yàn):以Wistar大鼠為研究對象，平均功率密度5、10、20、30 mW/cm2，3次/周，持續(xù)6周;離體實(shí)驗(yàn):以PC12及293T細(xì)胞系為研究對象，平均功率密

3、度30 mW/cm2，5 min×3次，每次間隔5 min;(2) MWM檢測大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能;(3)多導(dǎo)生理記錄及分析系統(tǒng)記錄分析大鼠腦電圖;(4)H&E染色觀察大鼠海馬組織結(jié)構(gòu);(5) HPLC檢測大鼠海馬和腦脊液中氨基酸及單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量;(6) MAO活性檢測試劑盒檢測大鼠海馬MAO活性;(7)WB檢測大鼠海馬TPH1含量及5-HT1A/2A/2CR表達(dá)量;(8)免疫組化檢測大鼠大腦皮層和海馬5-HT1A/2A/2CR表達(dá)

4、量;(9)全血提取大鼠DNA，PCR擴(kuò)增5-HT1A/2A/2CR基因啟動子區(qū)序列，測序法篩查SNP位點(diǎn);(10)報(bào)告基因及EMSA實(shí)驗(yàn)檢測候選SNP不同等位基因轉(zhuǎn)錄活性及微波輻射對不同等位基因轉(zhuǎn)錄活性的影響;(11)Real-Time PCR檢測各基因型大鼠5-HT1AR mRNA水平;(12)問卷調(diào)查和量表收集電廠職工基本資料并評估其精神狀態(tài);(13)采集電廠職工血液標(biāo)本，提取DNA后采用RFLP方法針對5-HT1A/2A/2CR的

5、SNP位點(diǎn)rs6311、rs6313、rs6314、rs6318、rs6295對人群進(jìn)行基因分型;檢測血常規(guī)、血清生化、BNP、LENK及NPY，并記錄ECG及ERPs等。
　　結(jié)果:
　　1.5-HT系統(tǒng)在微波輻射致認(rèn)知功能改變中的作用:(1)空間學(xué)習(xí)記憶功能:長期微波輻射（5、10、20、30 mW/cm2）可導(dǎo)致大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能降低。(2)腦電圖:輻射后14d，各劑量組大鼠腦電圖與假輻射組相比波幅增加、頻率降低、δ

6、頻段功率百分比增加。(3)海馬組織結(jié)構(gòu):輻射后14d、28 d及2m各劑量組大鼠海馬組織部分神經(jīng)元固縮深染，以齒狀回和CA3區(qū)損傷明顯，輻射后28 d，30 mW/cm2劑量組大鼠損傷程度最為嚴(yán)重。(4)神經(jīng)遞質(zhì):微波輻射后氨基酸及單胺類神經(jīng)遞質(zhì)紊亂，其中5-HT改變主要為遠(yuǎn)期效應(yīng):輻射后28 d，10、20及30 mW/cm2劑量組海馬組織5-HT增加;輻射后2m，各輻射劑量組5-HT均明顯增加，而其代謝產(chǎn)物5-HIAA明顯降低。(5

7、)5-HT合成及代謝中的限速酶TPH1及MAO:30 mW/cm2微波輻射后大鼠海馬TPH1表達(dá)未發(fā)生明顯改變，輻射后28 d及2m，MAO活性明顯降低。(6)5-HT1A/2A/2CR表達(dá):WB結(jié)果表明，海馬及大腦皮層5-HT2AR表達(dá)量無明顯改變。5-HT1AR及5-HT2CR在海馬組織的表達(dá)量于輻射后14d及2m明顯增加，28 d時(shí)明顯降低;免疫組化結(jié)果表明，輻射后14d，5-HT1AR在海馬CA1、CA2、CA3區(qū)表達(dá)明顯增加，

8、輻射后28 d，5-HT1AR在海馬CA1、CA2區(qū)表達(dá)明顯增加，輻射后2m，5-HT1AR在海馬CA3區(qū)表達(dá)量增加。輻射后14d及2m，5-HT2CR表達(dá)量在CA3區(qū)顯著增加，輻射后28 d，其在CA2區(qū)表達(dá)量明顯降低。WB及免疫組化結(jié)果均表明5-HT1AR及5-HT2CR在大鼠大腦皮層的表達(dá)于輻射后28d明顯增加。
　　2.大鼠5-HT受體基因啟動子區(qū)SNP位點(diǎn)與微波輻射致認(rèn)知功能改變易感性的相關(guān)性:(1)5-HTR基因啟動子

9、區(qū)SNP位點(diǎn)篩查:在不同動物中心的Wistar大鼠5-HT1A/2A/2CR基因啟動子區(qū)篩查到兩個(gè)SNP位點(diǎn):5-HT1AR-215 T＞C(rs198585630)及5-HT2AR74_75 ins G，Wistar大鼠rs198585630基因分型為TT、TC、CC基因型。(2)5-HT1AR rs198585630功能研究:①包含rs198585630-C等位基因的序列結(jié)構(gòu)啟動熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)功能強(qiáng)于包含T等位的序列結(jié)構(gòu)，3

10、0 mW/cm2微波輻射后含rs198585630-C的序列結(jié)構(gòu)啟動報(bào)告基因的表達(dá)功能明顯增強(qiáng);②C等位基因與PC12細(xì)胞核蛋白的結(jié)合能力明顯高于T等位基因，30 mW/cm2微波輻射PC12細(xì)胞后，T、C等位基因與核蛋白的結(jié)合能力均明顯增強(qiáng)，C等位與輻射后細(xì)胞核蛋白的結(jié)合能力明顯強(qiáng)于T等位。(3)5-HT1AR rs198585630與微波輻射后大鼠認(rèn)知功能改變易感性的相關(guān)性研究:①空間學(xué)習(xí)能力:TT型大鼠空間學(xué)習(xí)能力明顯低于TC及C

11、C型大鼠，30 mW/cm2微波輻射后TT型大鼠空間學(xué)習(xí)能力增強(qiáng)，TC、CC型大鼠空間學(xué)習(xí)、記憶能力降低;②腦電圖:輻射后14 d大鼠腦電圖波幅增加、頻率降低、δ頻段功率百分比明顯升高，其中TC、CC型大鼠δ頻段功率百分比的增加幅度高于TT型大鼠;③神經(jīng)遞質(zhì):TT型大鼠輻射后5-HIAA含量有降低趨勢而5-HT含量有升高趨勢，但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，5-HIAA/5-HT比值明顯降低;④5-HT1AR表達(dá):TC及CC型大鼠海馬組織5-HT1A

12、R mRNA及蛋白水平于微波輻射后明顯上調(diào)，輻射組中TC及CC型大鼠5-HT1AR mRNA及蛋白水平較TT型明顯增加。
　　3.5-HTR基因多態(tài)性與人群電磁輻射易感性關(guān)聯(lián)的初步探討:(1)心腦功能ECG、ERPs等與電磁輻射暴露劑量相關(guān):操作組及巡檢組工人較對照組心電圖異常發(fā)生率增加（主要為心率不齊、心動過緩、T波改變等）;巡檢組電力工人N2潛伏期與對照組及操作組比較，顯著增加;操作組較對照組BNP明顯增加;巡檢組較操作組LE

13、NK含量顯著上升。(2)5-HT1AR rs6295、5-HT2AR rs6313與輻射暴露劑量的交互作用對心腦功能的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義:rs6313 TT型隨暴露劑量增加，N2、P3潛伏期顯著延長，與CC型比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;rs6295 GG型隨暴露劑量增加，LENK含量增加，N2潛伏期顯著延長，與CG型比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。rs6313 TT型、rs6295 GG型對電磁輻射易感性高。
　　結(jié)論:
　　(1)長期微波(2.8

14、56 GHz，平均功率密度5、10、20及30 mW/cm2)輻射可致大鼠認(rèn)知功能損傷。(2)5-HT系統(tǒng)參與微波輻射所致認(rèn)知功能受損。(3)大鼠5-HT1AR基因啟動子區(qū)SNP-215 T＞C為功能性位點(diǎn)，包含C等位的啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄活性高于T等位，且C等位對微波輻射更為易感。(4)5-HT1AR-215 T＞C的TC、CC型大鼠于微波輻射后5-HT1AR高表達(dá)，促使認(rèn)知功能損傷。(5)長期電力作業(yè)可對工人心腦功能產(chǎn)生一定的影響。(6)5