小麥類脫水素基因的克隆和WZY1-1抗體的制備.pdf

1、LEA蛋白是當前植物胚胎學以及逆境生理學研究的熱點之一，胚胎晚期豐富蛋白(LEA蛋白)是一個大的基因家族，其表達產(chǎn)物LEA蛋白隨著種子脫水而合成的植物蛋白，其中一些蛋白能夠被干旱、高鹽、寒冷以及ABA等脅迫誘導。根據(jù)不同物種LEA蛋白的區(qū)域同源性將LEA分為六族。脫水素(dehydrin)屬于第二族LEA蛋白，能夠在植物胚胎發(fā)育后期以及逆境下大量表達，廣泛存在于植物界。它是具有高度熱穩(wěn)定性的親水性蛋白，有三類非常保守的區(qū)域，即K，Y和S

2、片段。脫水素作為一種脫水保護劑，能夠在干旱脅迫條件下穩(wěn)定細胞膜和許多大分子的結構，以避免脫水對細胞造成的傷害。 本實驗研究目的在于利用克隆的小麥脫水素基因構建的原核表達載體，通過純化的表達蛋白制備抗體，為研究小麥不同時期脫水素基因的表達情況，以及在組織和細胞中的分布奠定基礎。 本實驗在已克隆的PUC<,M>-T-WZY1-1基礎上，成功構建小麥類脫水素基因wzy1-1的原核表達載體PET-32a(+)-WZY1-1，轉(zhuǎn)化

3、到大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導表達得到融合蛋白，將純化后蛋白免疫兔子制得多克隆抗體，同時利用此抗體研究表達蛋白及小麥在干旱誘導和復水中脫水素基因的表達情況。通過研究表明： 1．得到一小麥的脫水素基因的克隆，構建小麥脫水素基因wzy1-1的原核表達載體，經(jīng)IPTG誘導得到目的融合表達蛋白，由于其特有的水溶性蛋白表達，所以為進一步的純化提供了便捷。 2．小麥類脫水素在大腸桿菌中獲得高效表達，表達蛋白經(jīng)Ni<'

4、2+>瓊脂糖凝膠親和層析和透析袋電洗脫法純化后，對兔子進行免疫，制備的抗血清通過ELISA檢測到較高的多克隆抗體效價。Western Blot結果顯示，利用純化的蛋白制備的兔抗血清可以很好的和所表達的蛋白帶特異性結合，而且也能與干旱脅迫處理后小麥葉片中的所表達的dehydrin蛋白特異性結合，證明其具有良好的免疫原性。 3．對鄭引1號小麥幼苗進行干旱脅迫處理后，提取可溶性蛋白質(zhì)，經(jīng)SDS-PAGE電泳，Western-blot檢

5、測顯示，在分子量28kd處出現(xiàn)特異的蛋白條帶，隨著PEG脅迫時間延長，電泳蛋白條帶逐漸加深，雜交信號越來越強，表明可溶性蛋白含量增加，復水之后蛋白條帶逐漸變淺，可溶性蛋白含量降低。 4．干旱脅迫下，通過以L29152全長mRNA其中的一個ORF框為模板，設計引物并通過RT-PCR克隆到了該基因，同時鑒定了該基因的核酸序列834bp，再構建該基因的原核表達載體，通過誘導得到有活性的融合蛋白，說明此基因并非只能在冷脅迫下進行表達，同