銀杏、油菜和薺菜脫水素基因的克隆和研究.pdf

1、脫水素是一類與胚胎發(fā)育和抗逆相關(guān)的蛋白質(zhì)，含有至少一個(gè)可以形成a-螺旋的K-片段。在受到環(huán)境脅迫如干旱、低溫、鹽堿等而導(dǎo)致植物體細(xì)胞脫水時(shí)，脫水素的表達(dá)量也隨之升高，這說明植物的抗逆與脫水素的表達(dá)量之間有一定的關(guān)系。轉(zhuǎn)基因研究表明，異源表達(dá)脫水素基因可以提高植物的抗逆性，脫水素基因在植物抗逆基因工程中具有很大的應(yīng)用潛力。 本文對(duì)植物脫水素基因進(jìn)行研究，以銀杏、油菜和薺菜為材料，利用RACE-PCR技術(shù)，成功地從中克隆出了脫水素基

2、因，并對(duì)其功能進(jìn)行了研究。 首次從銀杏中克隆到一個(gè)新的脫水素基因GbDHN。銀杏脫水素基因GbDHN全長(zhǎng)cDNA為820bp，含有一個(gè)489bp的開放閱讀框(0RF)，編碼一個(gè)有163個(gè)氨基酸殘基脫水素蛋白；預(yù)測(cè)的等電點(diǎn)(pD為5．75，分子量約為17kDa。GbDHN具有一個(gè)S．片段和一個(gè)K．片段，同源比對(duì)分析表明，這兩個(gè)片段的保守性很高。Southern雜交表明GbDHN屬于單拷貝的基因家族。RT-PCR用來進(jìn)行GbDHN的

3、表達(dá)圖譜分析。結(jié)果表明GbDHN是組織特異性表達(dá)的基因，在根和莖中都有表達(dá)。在外源脫落酸，干旱和鹽處理下，GbDHN的表達(dá)量都有所提高，這說明GbDHN的表達(dá)調(diào)控是通過依賴于脫落酸的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，而且該基因在植物體受到環(huán)境脅迫而脫水時(shí)，可能起到維持植物體正常生長(zhǎng)和發(fā)育的重要作用。利用基因組步移技術(shù)，克隆到銀杏脫水素基因GbDHN的5’．側(cè)翼區(qū)，并對(duì)其5’．側(cè)翼區(qū)進(jìn)行了生物信息學(xué)的分析，對(duì)啟動(dòng)子基本活性元件和脫落酸應(yīng)答相關(guān)的元件進(jìn)行了預(yù)測(cè)

4、。啟動(dòng)子基本活性元件TATA-box位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)前的-27bp處。GbDHN的5’．側(cè)翼區(qū)具有兩個(gè)脫落酸響應(yīng)元件(ABRE)。全長(zhǎng)cDNA序列和基因組DNA序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)該基因在編碼區(qū)具有一個(gè)為257bp的內(nèi)含子。 成功的從油菜中克隆獲得一個(gè)新的脫水素基因BnDHNERDIO。油菜脫水素基因BnDHNERDIO全長(zhǎng)cDNA為1114bp，含有一個(gè)816bp的開放閱讀框(ORF)，預(yù)測(cè)編碼有271個(gè)氨基酸的脫水素蛋白。預(yù)測(cè)

5、的等電點(diǎn)(pI)為5．09，分子量約為31kDa。BnDHNERDl0具有一個(gè)S．片段和兩個(gè)K-片段，同源比對(duì)分析表明，這兩個(gè)片段的保守性很高。RT-PCR用來進(jìn)行BnDHNERD1O的表達(dá)圖譜分析。結(jié)果表明BnDHNERDIO是組成型表達(dá)的基因，在根，莖和葉中都有表達(dá)。在外源脫落酸，低溫和鹽處理下，BnDHNERDl0的表達(dá)量都有所提高，這說明BnDHNERDl0的表達(dá)調(diào)控是通過依賴于脫落酸的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。通過基因組步移，克隆了油菜脫

6、水素基因BnDHNERDl0的5’-側(cè)翼區(qū)序列，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)的分析，對(duì)啟動(dòng)子基本活性元件和脫落酸應(yīng)答相關(guān)的元件進(jìn)行了預(yù)測(cè)。TATA-box位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)前的-25bp處。在5’-側(cè)翼區(qū)內(nèi)具有兩個(gè)脫落酸應(yīng)答元件ABREs。 從薺菜中克隆得到一個(gè)新的脫水素基因CbDHN。薺菜脫水素基因CbDHN的全長(zhǎng)cDNA為983bp，含有一個(gè)720bp的開放閱讀框(ORF)，編碼一個(gè)具有239個(gè)氨基酸的脫水素蛋白，預(yù)測(cè)計(jì)算的等電點(diǎn)(

7、pI)為5．2，分子量約為27kDa。CbDHN具有一個(gè)S．片段和三個(gè)K-片段，同源比對(duì)分析表明，這兩個(gè)片段的保守性很高。RT-PCR用來進(jìn)行CbDHN的表達(dá)圖譜分析。結(jié)果表明CbDHN是組成型表達(dá)的基因，在根，莖和葉中都有表達(dá)。在外源脫落酸，水楊酸，低溫，干旱和鹽處理下，CbDHN的表達(dá)量都有所提高，這說明CbDHN的表達(dá)是通過依賴于脫落酸的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。 為了進(jìn)一步研究基因的功能，我們構(gòu)建了四種植物表達(dá)載體：載體1(pCaM

8、V35S::BnDHN)，載體2(pCaMV35S：：GbDHN)，載體3(pCIP：：CbCORl5b，CIP：cold-inducedpromoter)和載體4(pGBP：：GUS)。構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，用目的基因替換pCAMBIAl304的相應(yīng)片段，構(gòu)建出目的基因植物表達(dá)載體。得到的重組載體即為目的基因的植物表達(dá)載體，通過凍融法將其轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，即獲得攜帶相應(yīng)植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌工程菌株。然后通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化煙