Dicer調(diào)控膽管癌細(xì)胞SFRP1基因啟動(dòng)子甲基化的機(jī)制及效應(yīng)研究.pdf

1、目的：研究Dicer對(duì)人膽管癌細(xì)胞HuCCT1中SFRP1基因啟動(dòng)子CpG島甲基化的影響，并初步探討其機(jī)制和生物學(xué)效應(yīng)。
　　方法：設(shè)計(jì)、合成Dicer基因特異性siRNA和saRNA，采用慢病毒載體建立穩(wěn)定細(xì)胞株。MSP與BSP實(shí)驗(yàn)分別定性和定量檢測(cè)SFRP1啟動(dòng)子CpG島甲基化狀態(tài)；啟動(dòng)子裁截實(shí)驗(yàn)檢測(cè) SFRP1啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)活性；HumanMethylation450K甲基化芯片分析全基因組及特異位點(diǎn) CpG島甲基化變化；Ch

2、IP實(shí)驗(yàn)檢測(cè) Dicer對(duì)HP1α與H3K9me3在SFRP1啟動(dòng)子區(qū)富集程度的影響；CCK-8法、劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力，裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力。
　　結(jié)果：
　　1.成功篩選出Dicer特異性siRNA和saRNA序列并建立了穩(wěn)定細(xì)胞株，慢病毒感染效率超過(guò)90％；western blot實(shí)驗(yàn)表明saR-Dicer組Dicer蛋白表達(dá)增加了2.33倍，而siR-Di

3、cer組Dicer蛋白表達(dá)降低了1.56倍，灰度分析顯示Dicer蛋白表達(dá)量與對(duì)照組比較，saR-Dicer組與 siR-Dicer組的相對(duì)表達(dá)量分別為3.33±0.27、0.39±0.05，P<0.01；Real time PCR結(jié)果顯示，saR-Dicer組與siR-Dicer組的Dicer mRNA相對(duì)表達(dá)水平分別為3.96±0.18，0.25±0.05，分別增加了2.96倍和降低了3倍，P<0.01。
　　2.在膽管癌細(xì)胞

4、株中，MSP實(shí)驗(yàn)表明SFRP1基因啟動(dòng)子呈高甲基化狀態(tài)；構(gòu)建了含CpG島和不含CpG島的SFRP1啟動(dòng)子裁截雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒（分別命名為 SFRP1-CpG-Luc和 SFRP1-null-Luc），甲基化處理后含有CpG島的啟動(dòng)子熒光活性下降27.56倍，P<0.01，而不含CpG島的啟動(dòng)子在甲基化處理后熒光活性變化不明顯。
　　3. HumanMethylation450K甲基化芯片結(jié)果顯示，siR-Dicer組和 sa

5、R-Dicer組細(xì)胞全基因組甲基化水平?jīng)]有明顯改變，但siR-Dicer組多個(gè)腫瘤相關(guān)基因（包括SFRP1）的啟動(dòng)子CpG位點(diǎn)發(fā)生了新的變化。
　　4.亞硫酸氫鹽測(cè)序（BSP）結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，siR-Dicer組SFRP1啟動(dòng)子區(qū) CpG位點(diǎn)甲基化水平進(jìn)一步增加，且有新的CpG位點(diǎn)發(fā)生了新的甲基化；而saR-Dicer組的CpG位點(diǎn)發(fā)生了部分去甲基化。
　　5.染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)（ChIP）顯示siR-Dicer組

6、HP1α和H3K9me3蛋白在SFRP1啟動(dòng)子區(qū)的富集水平顯著升高，而增強(qiáng)Dicer表達(dá)后變化不明顯,P>0.05。
　　6.與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組比較，siR-Dicer組細(xì)胞的增殖能力在感染48h后明顯增強(qiáng)，而saR-Dicer組細(xì)胞的增殖能力降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、siR-Dicer組和saR-Dicer組在48h后的劃痕愈合度分別是：0.35±0.03，0.47±0.68，0.0

7、8±0.01，0.75±0.11，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Transwell實(shí)驗(yàn)表明空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、saR-Dicer組和siR-Dicer組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為138±6.06，143.5±9.04，70±5.00，227.5±11.15；siR-Dicer組細(xì)胞裸鼠體內(nèi)成瘤能力增強(qiáng)，而saR-Dicer組細(xì)胞的成瘤能力下降。
　　結(jié)論：
　　1.在4種膽管癌細(xì)胞（HuCCT1、TFK-1、QBC939、CCLP1）中，S