17368.褶紋冠蚌cdna文庫構(gòu)建與timp基因的表達(dá)

1、學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得直昌太堂或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。學(xué)位論文作者簽名(手寫)：相參靶簽字日期：。阻年6月，之日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完

2、全了解南昌大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)南昌大學(xué)可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編本學(xué)位論文。同時(shí)授權(quán)中國科學(xué)技術(shù)信息研究所和中國學(xué)術(shù)期刊(光盤版)電子雜志社將本學(xué)位論文收錄到《中國學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫》和《中國優(yōu)秀博碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫》中全文發(fā)表，并通過網(wǎng)絡(luò)向社會(huì)公眾提供信息服務(wù)。(

3、保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書)學(xué)位論文作者簽名(手寫)：陽壺靶簽字日期：≯口，z年占月肛日簽字日)：月／多日摘要lIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIY2141411摘要褶紋冠蚌(CristariaPlicata)是中國“淡水育珠蚌”之一，由于其易受病原體侵染而經(jīng)常發(fā)病，給其育珠能力產(chǎn)生了較大的影響。因此對(duì)其進(jìn)行分子免疫方面的研究是有必要和實(shí)際意義的。本文用Trizol法提取總RNA，依據(jù)SMART試劑盒說明方法合成cDNA，

4、用sfiI酶切，將處理過的PCR產(chǎn)物和pBluescriptIISK載體相連接，構(gòu)建褶紋冠蚌血細(xì)胞全長cDNA文庫。經(jīng)檢測，其滴度為107x106cfu／mL，重組率為96％，平均插入片段為732bp。說明所構(gòu)建的褶紋冠蚌血細(xì)胞文庫屬質(zhì)量高的全長cDNA，挑500個(gè)克隆進(jìn)行測序，獲得297條EST，經(jīng)分析，己知功能的ESTs為123個(gè)，按生物學(xué)功能把它們可以分成了七類。對(duì)堿基為821bp的EST片段，進(jìn)行比對(duì)分析后，認(rèn)為它是褶紋冠蚌TI

5、MP基因，經(jīng)測定發(fā)現(xiàn)它在閉殼肌中表達(dá)最大，而在血細(xì)胞、外套膜、肝胰腺和性腺中表達(dá)量則低得多。注射嗜水氣單胞菌6，12，24，48h后，經(jīng)熒光定量分析測定，其在血細(xì)胞，肝胰腺，鰓表達(dá)水平均有一定量的升高。設(shè)計(jì)含酶切位點(diǎn)的表達(dá)引物，從褶紋冠蚌的血液中提取總RNA，利用RT—PCR法擴(kuò)增出TIMP基因，經(jīng)基因序列分析后構(gòu)建表達(dá)載體PET一30a()一TIMP，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，再經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)TIMP表達(dá)，利用SDS—PAGE分析表達(dá)產(chǎn)

6、物。最后利用N2_NTA將其融合蛋白純化出來。結(jié)果表明重組的TIMP在大腸桿菌(Escherichiacoli)37。C下誘導(dǎo)均以包涵體形式存在，大小為32KDa左右；其N端表達(dá)產(chǎn)物為20KDa左右。優(yōu)化表達(dá)條件后，加lmMIPTG，15。C下誘導(dǎo)34h，其N端表達(dá)產(chǎn)物有可溶性蛋白存在，并可以純化出來。即可通過基因克隆和原核表達(dá)的方式可以獲得具有生物活性的T／MP融合蛋白。關(guān)鍵詞：褶紋冠蚌，cDNA文庫，EST(表達(dá)序列標(biāo)簽)，TIMP