胰島δ細胞對新生鼠血糖穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)作用研究.pdf

1、目的：
　　胰島主要由分泌胰高血糖素的α細胞，分泌胰島素的β細胞，分泌生長抑素的δ細胞，分泌饑餓激素的ε細胞以及分泌胰多肽的PP細胞構(gòu)成。其中胰島β細胞作為體內(nèi)分泌胰島素的唯一細胞類型，在血糖調(diào)節(jié)中起著至關重要的作用，β細胞的功能異常通常會導致糖尿病等代謝性疾病，因此β細胞一直是研究的熱點。隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)，在胰島中不同的細胞類型之間存在相互的調(diào)節(jié)作用。胰島δ細胞通過旁分泌生長抑素的方式對胰島α細胞和β細胞的活性進行調(diào)

2、控。由藥物或遺傳因素導致的δ細胞中生長抑素的異常分泌，可導致β細胞的內(nèi)分泌功能失調(diào)，并進而引發(fā)糖代謝紊亂和相關代謝性疾病。
　　盡管胰島δ細胞的研究已經(jīng)取得了一定的進展，但對于其功能尤其是在血糖穩(wěn)態(tài)調(diào)控中的作用，目前仍存在較大爭議。已有研究表明，盡管生長抑素基因敲除小鼠的進食后胰島素和胰高血糖素分泌水平均有顯著增高，但這些小鼠依然具有和正常小鼠相似的體重、胰島形態(tài)、胰島素和胰高血糖素含量、靜息血糖水平和胰島素敏感度。因此，這些研究

3、結(jié)果提示胰島δ細胞可能并不參與靜息狀態(tài)下血糖調(diào)控。為了對這一問題進行深入研究并進一步解析δ細胞在胰島環(huán)路以及血糖穩(wěn)態(tài)中的作用，本實驗利用Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)，構(gòu)建了可在分泌生長抑素的細胞中特異性表達白喉毒素A片段的小鼠。由于白喉毒素A片段能夠抑制蛋白質(zhì)的合成進而殺死細胞，因此小鼠體內(nèi)δ細胞可被特異性敲除。對該δ細胞特異性敲除小鼠的生理表型進行了研究，并采用連續(xù)切片技術(shù)和免疫熒光的方法，通過胰腺組織的免疫熒光共染，實時定量聚合酶鏈式

4、反應(quantitative polymerase chain reaction，Q-PCR)和酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)等實驗方法進一步研究了δ細胞在血糖穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中的作用。
　　方法：
　　本實驗選用的實驗鼠為C57BL/6J小鼠，分別為胚胎期12.5天(E12.5)、15.5天(E15.5)和18.5天(E18.5)的胚胎鼠，新生1天的小鼠(P1)

5、，以及出生后1周(1week)和8周(8week)小鼠，以及SSTCre(+/+)和R26DTA(+/-)兩種工具鼠，兩者雜交獲得SSTCre(+/-)和S STCre(+/-);R26DTA(+/-)兩種實驗鼠。另外還選用wistar大鼠乳鼠。取各時間點小鼠的胰腺，運用連續(xù)切片技術(shù)和免疫熒光的方法，通過胰腺組織的免疫熒光共染，包括生長抑素和胰島素的共染以及生長抑素與胰高血糖素的共染，直觀顯示胰島δ細胞在小鼠不同發(fā)育階段的形成及分布情況

6、。通過免疫熒光和激光共聚焦顯微技術(shù)以及Q-PCR的方法驗證SSTCre(+/-);R26DTA(+/-)鼠胰島δ細胞的特異性敲除情況。通過生長抑素和胰島素的共染以及生長抑素與胰高血糖素的共染，直觀顯示δ，α和β細胞在SSTCre（+/-）和SSTCre（+/-);R26DTA（+/-)這兩種小鼠以及各時間點小鼠中的數(shù)目和分布情況。通過Q-PCR的方法檢測小鼠中胰高血糖素，胰島素，胰多肽和饑餓激素的mRNA水平。采用ELISA實驗分別檢測

7、小鼠血漿和胰腺中胰島素和胰高血糖素的含量。
　　結(jié)果：
　　通過系統(tǒng)研究胰島δ細胞的發(fā)育發(fā)現(xiàn)，E15.5時δ細胞開始分化出現(xiàn);E18.5天和P1的小鼠胰島初步形成，但尚不規(guī)則;1周小鼠胰島基本規(guī)則成型;4周和8周小鼠胰島形狀穩(wěn)定規(guī)則;δ細胞分布于胰島的外周。通過免疫熒光實驗和Q-PCR確證了SSTCre（+/-);R26DTA（+/-)小鼠胰島內(nèi)的δ細胞敲除情況。δ細胞特異性敲除小鼠表現(xiàn)出嚴重的低血糖癥狀，其體重與血糖水平均

8、明顯低于SSTCre(+/-)對照組小鼠，并于出生后24小時內(nèi)死亡，通過給其皮下注射葡萄糖可以在一定范圍內(nèi)延長SSTCre(+/-);R26DTA(+/-)小鼠的平均壽命。ELISA的實驗結(jié)果顯示，SSTCre(+/-);R26DTA(+/-)小鼠血漿中的胰島素水平明顯高于SSTCre(+/-)小鼠，并且SSTCre(+/-);R26DTA(+/-)小鼠胰腺內(nèi)的胰島素和胰高血糖素含量均高于SSTCre(+/-)小鼠。免疫熒光實驗結(jié)果表明

9、，雖然SSTCre(+/-);R26DTA(+/-)小鼠的胰島細胞總數(shù)目相較于S STCre(+/-)小鼠并無明顯差別，但是δ細胞的特異性敲除導致小鼠胰島內(nèi)α細胞和β細胞的比例明顯上升。
　　結(jié)論：
　　本實驗的結(jié)果直觀的顯示了小鼠胰島δ細胞的產(chǎn)生和分布情況，胰島δ細胞的發(fā)生及其與胰島內(nèi)其他內(nèi)分泌細胞之間的相互作用與胰島發(fā)育過程密切相關。胰島δ細胞可能通過旁分泌的方式對胰島的形態(tài)發(fā)生和發(fā)育起到重要的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，胰島δ