新生鼠低血糖腦損傷和丙酮酸鈉對(duì)其神經(jīng)保護(hù)作用的研究.pdf

1、研究背景及目的： 持續(xù)不斷的血糖供應(yīng)是保持腦功能正常的基本要求。由于多種原因使得生后能量代謝適應(yīng)過(guò)程發(fā)生異常而使新生兒階段成為人一生中最易發(fā)生低血糖的階段。反復(fù)的、嚴(yán)重的新生兒低血糖可以造成不可逆的腦損傷，導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，但至目前為止我們對(duì)反復(fù)、嚴(yán)重的新生期低血糖造成不可逆腦損傷的機(jī)制了解甚少。在臨床實(shí)踐中單純研究新生兒低血糖是受限制的，因?yàn)榈脱浅０榘l(fā)在其它疾病中，而且我們尚沒(méi)有一個(gè)可靠的新生期低血糖腦損傷的動(dòng)物模型

2、來(lái)進(jìn)行深入的研究。因此建立一個(gè)可靠的新生期低血糖腦損傷的動(dòng)物模型是十分必要和迫切的。多年來(lái)對(duì)成熟腦低血糖損害的研究表明，嚴(yán)重低血糖時(shí)，腦組織得不到足夠葡萄糖的供應(yīng)，使腦電活動(dòng)減少，游離脂肪酸和氨基酸代謝障礙，使谷氨酸的水平增加，低血糖腦損傷是谷氨酸的中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性中毒的最終結(jié)果。 本課題首先建立一個(gè)可靠穩(wěn)定的新生期低血糖的動(dòng)物模型，然后在此動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上探討線(xiàn)粒體功能異常在低血糖導(dǎo)致神經(jīng)元死亡的機(jī)制中的作用，最后給予低血糖

3、動(dòng)物額外提供丙酮酸鈉，探討丙酮酸鈉對(duì)反復(fù)嚴(yán)重新生期低血糖腦損傷動(dòng)物神經(jīng)元及其功能是否具有保護(hù)性，為臨床治療新生兒低血糖，防止低血糖腦損傷后遺癥建立新的思路和提供理論依據(jù)。 研究方法： 1.建立反復(fù)嚴(yán)重新生期低血糖腦損傷的大鼠模型。實(shí)驗(yàn)采用新生Wistar大鼠，胰島素15 U/kg皮下注射和饑餓的方法誘導(dǎo)低血糖。160只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為胰島素處理S組(insulin-treated rats with short hypo

4、glycemia，INS-S，n=40)、胰島素處理P組(insulin-treated rats with prolonged hypoglycemia，INS-P，n=40)、饑餓組(fasted rats，F(xiàn)AS，n=40)和對(duì)照組(control rats，CON，n=40)。INS-S組新生鼠低血糖持續(xù)1.5h，INS-P組新生鼠低血糖持續(xù)2.5h，F(xiàn)AS組新生鼠饑餓12h，處理中用微量血糖儀對(duì)新生鼠血糖進(jìn)行檢測(cè)。新生鼠低血糖

5、的誘導(dǎo)在生后第二天(postnatal day,P2)、P4和P6進(jìn)行3次，第三次低血糖處理后2h、6h、1d、3d、7d、14d取腦，制作腦組織切片經(jīng)Fluoro-Jade B染色，計(jì)數(shù)大腦旁矢狀面皮層、海馬CA1區(qū)(cornu ammonis sector 1，CA1)、CA3、海馬齒狀回(dentate gyrus of hippocampus，DG)、丘腦、下丘腦和梨狀皮層7個(gè)區(qū)域變性神經(jīng)元的數(shù)目。并在最后一次低血糖后6h取海馬

6、CA3區(qū)進(jìn)行電鏡檢查。 2.反復(fù)嚴(yán)重新生期低血糖腦損傷機(jī)制的研究：158只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為INS-P組(n=79)和CON(n=79)組。①線(xiàn)粒體膜電位的檢測(cè)：低血糖處理后6h取新鮮大腦皮層制作單個(gè)神經(jīng)元的懸液，用羅丹明123(Rhodamine123，Rho123)染色后流式細(xì)胞儀檢測(cè)神經(jīng)元懸液Rho 123的熒光強(qiáng)度。②胞漿cyt c水平的檢測(cè)：低血糖處理后2h、6h、1h、3h、7h、14h取新鮮大腦皮層組織，低溫差速離心法提取神

7、經(jīng)元的胞漿蛋白，western blot法檢測(cè)大腦皮層神經(jīng)元胞漿內(nèi)cyt c的水平。③活化caspase-3的檢測(cè)：低血糖處理后2h、6h、1h、3h、7h、14h取腦，用熒光免疫組化的方法檢測(cè)caspase-3 P20在細(xì)胞中的表達(dá)，同時(shí)應(yīng)用特異性神經(jīng)核抗原(neuronal nuclear protein，NeuN)鑒定細(xì)胞類(lèi)型，并觀察神經(jīng)元形態(tài)的變化。 3.丙酮酸鈉給藥對(duì)反復(fù)嚴(yán)重新生期低血糖腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用：36只實(shí)驗(yàn)

8、動(dòng)物隨機(jī)分為胰島素處理P組(insulin-treated rats with prolonged hypoglycemia，INS-P，n=12)、胰島素處理+丙酮酸鈉組(insulin-treated rats with prolonged hypoglycemia+pyruvate，INS-PP，n=12)和對(duì)照組(control rats，CON，n=12)。在終止實(shí)驗(yàn)動(dòng)物低血糖的同時(shí)給予INS-PP組新生鼠丙酮酸鈉(500mg

9、/kg)。于第三次低血糖處理后1d取腦制作腦組織切片，F(xiàn)luoro-Jade B染色計(jì)數(shù)各腦區(qū)變性神經(jīng)元。第三次低血糖處理后六周Morris水迷宮測(cè)試大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力。 研究結(jié)論： 1.胰島素(15 U/kg)皮下注射可誘導(dǎo)出新生大鼠低血糖的發(fā)生，且新生大鼠對(duì)胰島素的敏感性和耐受性良好，饑餓12h也可誘導(dǎo)出新生大鼠輕度的低血糖。 2.反復(fù)嚴(yán)重的新生期低血糖可造成大鼠明顯的腦損傷，皮層、丘腦、下丘腦、海馬齒狀

10、回是反復(fù)嚴(yán)重新生期低血糖的易損區(qū)。 3.Fluoro-Jade B染色是一種有效的新生鼠低血糖腦損傷神經(jīng)元變性的檢測(cè)辦法。 4.反復(fù)嚴(yán)重的新生期低血糖腦損傷中，存在神經(jīng)元線(xiàn)粒體△ψm下降，cyt c釋放，caspase-3激活，神經(jīng)元呈現(xiàn)凋亡的形態(tài)學(xué)特征，線(xiàn)粒體介導(dǎo)的細(xì)胞死亡程序在反復(fù)嚴(yán)重的新生鼠低血糖腦損傷發(fā)生機(jī)制中起到一定的作用。 5.丙酮酸鈉對(duì)反復(fù)嚴(yán)重新生鼠低血糖時(shí)神經(jīng)元及其功能具有明顯的保護(hù)作用。

11、 創(chuàng)新和意義： 1.本研究首次建立反復(fù)嚴(yán)重新生期低血糖腦損傷的大鼠模型，并應(yīng)用變性神經(jīng)元的特異性熒光染料證實(shí)其腦損傷的存在，發(fā)現(xiàn)反復(fù)嚴(yán)重新生期低血糖腦損傷的易損區(qū)，與成熟腦略有不同。 2.研究證實(shí)了線(xiàn)粒體介導(dǎo)的細(xì)胞死亡程序在反復(fù)嚴(yán)重新生鼠低血糖腦損傷發(fā)生機(jī)制中起到一定的作用；反復(fù)嚴(yán)重新生鼠低血糖可導(dǎo)致神經(jīng)元的凋亡。 3.研究證明丙酮酸鈉對(duì)反復(fù)嚴(yán)重新生鼠低血糖腦損傷神經(jīng)元及其功能具有保護(hù)作用，為反復(fù)嚴(yán)重新生期低血糖