草地重建中羊草葉片cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及光合作用基因的克隆與分析.pdf

1、目前環(huán)境污染，水土流失、土地荒漠化過程加劇，草原退化、森林面積和耕地資源萎縮，土壤鹽漬化和沙化、水資源匱乏且被污染等生態(tài)環(huán)境問題、生物多樣性銳減、生物資源被破壞等成為制約國(guó)民經(jīng)濟(jì)健康持續(xù)發(fā)展的制約因素。植被建設(shè)是生態(tài)環(huán)境恢復(fù)與重建的主要任務(wù)和目標(biāo)。 植被建設(shè)所必須遵從基本原則是既要體現(xiàn)它的生態(tài)性、又要體現(xiàn)它的經(jīng)濟(jì)性和社會(huì)性。依據(jù)這一基本原則，選擇和培植適宜低劣環(huán)境、具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)效益的植物品種材料是生態(tài)環(huán)境設(shè)中一項(xiàng)極端

2、重要的任務(wù)和研究?jī)?nèi)容。本研究的目標(biāo)就在于利用現(xiàn)代生物技術(shù)，為草原生態(tài)修復(fù)培植具有優(yōu)良生長(zhǎng)習(xí)性的牧草品種。 羊草(Leymus chinensis(Trin.)Tzvel.)又稱堿草，屬禾本科賴草屬，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，富含蛋白質(zhì)，適口性好，抗旱，耐鹽堿，耐貧瘠，抗逆性強(qiáng)，適應(yīng)性廣等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)發(fā)展草原畜牧業(yè)和退化草地修復(fù)、荒漠化治理等具有舉足輕重的作用。近年來，由于自然環(huán)境變劣，荒漠化加劇，以及過度放牧等不利影響，加之羊草本身遺傳特性有

3、“三低”問題(即結(jié)實(shí)率低、出苗率低、產(chǎn)草量低)，己對(duì)羊草生物種群優(yōu)勢(shì)構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅，限制了我國(guó)人工草地建設(shè)和天然草地的改良和土壤沙漠化治理等生態(tài)環(huán)境建設(shè)與修復(fù)的步伐。加強(qiáng)羊草生物學(xué)基礎(chǔ)研究成為當(dāng)前最為緊迫的研究課題。國(guó)內(nèi)外已有的研究報(bào)導(dǎo)大多集中在草原生態(tài)等宏觀領(lǐng)域，而在羊草生物學(xué)方面缺乏系統(tǒng)的科學(xué)研究。為了提高羊草的生長(zhǎng)量，逐步改善其“三低”問題，使其在生態(tài)環(huán)境建設(shè)中能夠發(fā)揮更大的作用，本研究以羊草幼苗葉片為實(shí)驗(yàn)材料，利用試劑盒構(gòu)建羊

4、草葉片cDNA文庫(kù)，并利用M13通用引物篩選文庫(kù)獲得其與光合作用相關(guān)的nabisco大小亞基基因，為挖掘羊草光合作用基因資源，為進(jìn)一步改良羊草生物學(xué)習(xí)性奠定基礎(chǔ)。獲得了以下結(jié)果： 1.采用CLONETCH公司的SMART TM cDNA Library Construction Kit試劑盒及SMART(Switching Mechanism At 5′end of RANA Transcript)技術(shù)，成功的構(gòu)建了羊草葉片c

5、DNA文庫(kù)，原始文庫(kù)都達(dá)到10<'6>cfu/ml，擴(kuò)增文庫(kù)滴度接近10<'11>cfu/ml，重組率達(dá)到98％。PCR檢測(cè)插入片段，均在0.5kb到2.5kb之間，主要集中在大于1kb的區(qū)域，約占70％左右。從文庫(kù)中檢測(cè)到了羊草維生素E生物合成的關(guān)鍵酶基因α-生育酚環(huán)化酶(TC)及γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶(γ-TMT)的特異信號(hào)，表明所獲得文庫(kù)具有較高的覆蓋度，并為PCR篩選文庫(kù)提供了可能。 2．在此文庫(kù)的基礎(chǔ)上，利用M13通用

6、引物進(jìn)行篩選，挑選大小合適的單克隆，進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序所獲得的cDNA序列結(jié)果在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Centerfor Biotechnology Information,NCBI)網(wǎng)站http：//www．ncbi．nlm．nih．gov．的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)上與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)公布的其他物種的基因進(jìn)行比對(duì)和分析，初步確定所克隆到的部分基因(已登錄

7、50條，在NCBI中的庫(kù)號(hào)為L(zhǎng)eymus chinensis cv Jisheng No．1 leaf cDNA library)。 3．從亞文庫(kù)中篩選到與光合作用相關(guān)的Rubisco大小亞基基因，在GenBank上進(jìn)行比對(duì)，Rubisco大亞基基因長(zhǎng)度為1796bp，與禾本科大麥、小麥、野雀麥、粗山羊草、旱麥草、異形花草、黑麥等的核苷酸序列同源性達(dá)98％以上。而羊草的Rubisco小亞基基因部分序列含有一個(gè)開放閱讀框長(zhǎng)度為1